賀璐，龍承星，劉又嘉，惠華英，譚周進

1(湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙，410208) 2(湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，湖南 長沙，410208)3(湖南中醫(yī)藥大學 醫(yī)學院，湖南 長沙，410208) 4(湖南人文科技學院 數學與金融學院，湖南 婁底，417000)

微生物乳糖酶研究進展

賀璐1，龍承星2,4，劉又嘉2，惠華英1，譚周進3*

1(湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙，410208) 2(湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，湖南 長沙，410208)3(湖南中醫(yī)藥大學 醫(yī)學院，湖南 長沙，410208) 4(湖南人文科技學院 數學與金融學院，湖南 婁底，417000)

乳糖酶是一種分解乳糖產生半乳糖和葡萄糖的雙糖酶，在乳品生產、醫(yī)藥助消化、果菜成熟軟化、環(huán)境保護等方面具有重大應用價值。微生物是產乳糖酶的主要來源，具有生長繁殖快、酶量豐富、生產成本低、適合工業(yè)化生產等特點。通過查閱國內外文獻，對微生物乳糖酶研究從微生物乳糖酶特點、產乳糖酶主要微生物、基因工程技術在乳糖酶生產上的應用及微生物乳糖酶的應用等領域進行了綜述，為產乳糖酶微生物的開發(fā)、乳糖酶基因工程技術的應用等提供參考。

微生物；乳糖酶；特點；基因工程

乳糖酶能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，還可以通過半乳糖苷轉移作用生成功能性低聚半乳糖，又稱β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactoside-galactohydrolase E.C.3.2.1.23)。乳糖酶在乳制品加工、醫(yī)藥、環(huán)境、食品等領域得到廣泛應用，在醫(yī)藥上主要用來治療乳糖不耐受癥[1]。荷蘭生物學家1889年首次報道乳糖酶能水解乳糖以來[2]，乳糖酶的研究日漸完善。20世紀60年代，國外學者成功研制出一系列微生物乳糖酶商品并投放市場，國內在20世紀80年代以后開始微生物乳糖酶的研究，但主要集中在產酶菌株的篩選、產酶條件的優(yōu)化、乳糖酶的分離純化及酶學性質等的研究，取得了一些進展。

乳糖酶的來源非常豐富，包括植物來源、動物來源和微生物來源。植物來源如杏、李、桃、蘋果和咖啡豆等，動物來源主要有腸、腦、消化器官和皮膚組織，微生物來源有細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等，只有微生物乳糖酶具有工業(yè)應用價值[3]。本文主要歸納總結了微生物乳糖酶的生化特性、主要產酶菌株及高產菌株的優(yōu)化方法和微生物乳糖酶的應用。

1 微生物乳糖酶的特點

微生物具有代謝高效、生長繁殖快的優(yōu)點，其應用優(yōu)勢明顯。微生物乳糖酶性質多樣、來源廣泛、酶活力高且容易制備。利用微生物發(fā)酵法制備乳糖酶具有周期短、生產成本低、產量高的特點，且不受地理位置、季節(jié)等的影響，能滿足各種需求且便于工業(yè)化規(guī)模生產，是目前商用乳糖酶的主要生產方法[4]。乳糖酶分為胞外酶和胞內酶，細菌和酵母菌產生的乳糖酶一般為胞內酶，霉菌產生的乳糖酶為胞外酶。不同來源的微生物乳糖酶性質差異巨大(表1)，細菌乳糖酶一般為常溫乳糖酶，最適作用溫度一般在40 ℃左右，如卷曲乳桿菌ATCC33820和大腸桿菌的乳糖酶的最適溫度分別為45 ℃和40 ℃。有些細菌乳糖酶的作用溫度可達90℃，也有些耐冷產乳糖酶菌株產生的乳糖酶在低溫下仍保持較高酶活性，如拉恩氏茵屬(Rahnellasp.)產生的乳糖酶在4 ℃仍保持最高酶活性的40%[5]。細菌乳糖酶的最適pH值近中性，一般為6.5～7.5，具有酶性質穩(wěn)定、易于發(fā)酵等優(yōu)勢。酵母菌乳糖酶的最適作用溫度一般在37 ℃左右，最適作用pH近中性，與牛乳的天然pH值接近，被廣泛用于牛乳和乳清中乳糖的水解，但由于是胞內酶，不易提取[6]。霉菌產生的乳糖酶是胞外酶，提取方便，一般作用溫度較高，在50 ℃以上，最適pH值偏酸性，分子量較小，主要用于酸性乳清和干酪的水解。微生物乳糖酶的用途廣泛，但游離的乳糖酶存在價格昂貴、添加量大且不利于產品分離純化等缺點，研究者們在固定化酶方面進行了研究與探索。研究表明，利用殼聚糖微球載體、苯乙烯馬來酸酐共聚物納米纖維載體和氨基化細菌纖維素載體固定β-半乳糖苷酶，能使乳糖酶具較好的儲存和操作穩(wěn)定性，并能提高酶的活性和回收利用率[7]。

表1 一些微生物乳糖酶的性質

2 產乳糖酶的主要微生物

微生物種類多，特性不一。產乳糖酶的微生物有細菌、放線菌、酵母菌和霉菌，其中細菌占絕大多數，其次是霉菌，酵母菌和放線菌較少。大量細菌能產生乳糖酶，但僅有極少數的細菌可作為乳糖酶的安全來源，Streptococcusthermophilus是其中的一種，可用作酸奶酪和一些乳酪的發(fā)酵劑[16]。酵母菌可產生大量的乳糖酶，適用于牛奶和乳清的水解，主要包括Klugeveromycesmarxianus、Klugeveromyceslactis、Guchomycespullulans和Candidakefr[20]。目前常用的乳糖酶制劑來源菌中，乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、米曲霉和黑曲霉等在食品工業(yè)中被認為是安全的[21]，符合美國FDA(Food and Drug Administration)的GRAS (generally regarded as safe) 的要求。表2列舉了一些主要的產乳糖酶微生物及商品化乳糖酶，例如荷蘭帝斯曼公司的來源于乳酸克魯維酵母的Maxilact系列、美國紐約酶發(fā)展公司生產的來源于黑曲霉的Fungal lactase，我國的哈爾濱美華生物技術股份有限公司生產的中性乳糖酶來源于脆壁克魯維酵母，但乳糖酶產量依然偏低，在乳品工業(yè)中的應用仍受到限制。以后的研究中，應著力于研究如何提高微生物商品化乳糖酶的產量，使其能更好地應用于工業(yè)生產。

表2 產乳糖酶的微生物及其商品化乳糖酶

3 乳糖酶高產菌株的選育

乳糖酶在醫(yī)藥、乳品、環(huán)境保護、分析等方面應用廣泛，然而產量低下限制了乳糖酶的應用及規(guī)?；a。研究者們在乳糖酶高產菌株選育方面開展了大量的工作，主要技術集中在誘變育種和基因工程。乳糖酶高產菌株的誘變選育主要是通過60Co-γ射線照射、紫外線照射和亞硝基胍處理等進行誘變后，然后進行篩選。采用紫外線和60Co-γ射線協(xié)同誘變對出發(fā)菌株Uco-3的原生質體進行處理后，篩選突變株產生的乳糖酶活性由原來的16.27 u/mL可以提高到44.37 u/mL[44]。

隨著基因工程技術的發(fā)展，乳糖酶高產菌株的選育取得了很好的成效?；蚬こ碳夹g將性狀優(yōu)良的乳糖酶基因導入易于培養(yǎng)且生長迅速的微生物，獲得重組乳糖酶基因工程菌，再進行發(fā)酵條件優(yōu)化，提高乳糖酶生產含量，降低生產成本。乳糖酶基因的表達系統(tǒng)有三大類，分別是畢赤酵母表達系統(tǒng)、大腸桿菌表達系統(tǒng)和乳酸菌表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應用最成熟、最廣泛的原核表達系統(tǒng)，具有產量高、成本低、生長快及遺傳背景清楚等優(yōu)點，但真核基因在這種表達系統(tǒng)中沒有翻譯和修飾功能，所表達的目的蛋白常以不溶性包涵體形式存在，必須通過變性復性得到天然活性蛋白，表達的產物往往沒有生物活性或生物活性很低。將嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳糖酶基因導入大腸桿菌后進行表達，結果發(fā)現重組蛋白的催化活性高出原來菌株約50倍，這是因為嗜熱脂肪芽孢桿菌的乳糖酶基因是原核基因，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中能直接表達[45]。畢赤酵母表達系統(tǒng)是目前發(fā)展最迅速、應用最廣泛的外源蛋白質表達系統(tǒng)，在蛋白質生產中具有無比廣闊的前景，主要特點是能利用甲醇作為能量來源和唯一碳源。這種表達系統(tǒng)具有蛋白修飾和翻譯功能，穩(wěn)定性高、表達能力強、遺傳背景清楚、生長迅速，易于培養(yǎng)，生產成本低，適合高密度的發(fā)酵培養(yǎng)和商業(yè)化生產。把環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的乳糖酶基因導入畢赤酵母中進行表達，目的蛋白表達量提高了2倍[46]。乳酸菌表達系統(tǒng)操作安全、簡單、可誘導表達，也被廣泛用于外源基因的表達。除此之外，還可以通過基因敲除的方法獲得乳糖酶高產菌株。基因敲除技術是上世紀80年代末發(fā)展起來的，是指通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術，主要包括同源重組技術、基因隨機插入突變和RNAi基因敲除技術。將K.Marxianukm菌株的MIG1基因敲除后，乳糖酶基因的轉錄水平提高了2倍，酶生物合成量也明顯提高[47]。隨著新技術的發(fā)展，乳糖酶高產菌株的選育將有更大的進步。

利用基因工程技術得到的高產菌株固然能增大乳糖酶的產量，然而將其廣泛應用于商業(yè)化生產還存在諸多問題。比如技術要求高導致生產成本升高；乳糖酶主要應用于食品醫(yī)藥方面，轉基因菌株生產的酶可能存在潛在的危害。

4 微生物乳糖酶的應用

4.1 食品方面的應用

微生物來源的乳糖酶在食品工業(yè)中的一個重要應用是合成低聚半乳糖。低聚半乳糖是一種益生元，能夠改善腸道菌群、增強免疫系統(tǒng)。低聚半乳糖難以被小腸吸收，還具有糖類的共有屬性和較好的口感，被廣泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的無熱量食品。工業(yè)上低聚半乳糖主要采用酶法合成，尤其以微生物來源的β-半乳糖苷酶為主。β-半乳糖苷酶既能催化β-D-半乳糖苷鍵的水解，也可催化半乳糖基轉移生成低聚半乳糖的轉糖苷反應，因此能催化乳糖生成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶制作的酸乳風味和口感較好，保質期較一般乳制品長。

4.2 醫(yī)藥方面的應用

乳糖不耐受癥是目前在全世界人群中較常出現的一種癥狀，醫(yī)藥領域將β-半乳糖苷酶做成酶制劑，以治療乳糖不耐受癥疾病以及多種兒童消化不良癥[5]。

4.3 作為報告基因的應用

β-半乳糖苷酶可作為某些檢測載體的報告基因或用于腸桿菌的鑒定。如利用β-半乳糖苷酶水解對硝基酚-β-D-半乳糖苷，生成對硝基酚(pNP)游離而呈現黃色的性質，采用酶標儀在405 nm波長下比色，依據光密度值確定腸桿菌中具有β-半乳糖苷酶的菌屬的菌量[48]。李杰[49]等研究發(fā)現，利用β-半乳糖苷酶基因作為報告基因構建耐輻射異常球菌啟動子的檢測載體，能深入了解耐輻射異常球菌的抗逆基因在不同脅迫下的功能。

4.4 免疫和檢測的應用

金國祥建立了以β-半乳糖苷酶為標志性抗原的小鼠黑色素瘤模型——galBl6腫瘤模型，以β-半乳糖苷酶表達載體作為DNA疫苗，在galBl6腫瘤模型上做了抗腫瘤免疫的實驗，結果表明β-半乳糖苷酶基因疫苗具有抑制galBl6腫瘤生長的作用[50]。

4.5 環(huán)保方面的應用

乳清中含有乳糖、維生素、乳清蛋白和礦物質等營養(yǎng)成分，每年世界上約產乳清9×107T，其中50%當廢水排放，不僅造成浪費，而且污染環(huán)境。用β-半乳糖苷酶水解乳清中的乳糖，可以提高含乳清飼料的營養(yǎng)價值，減少環(huán)境污染。

4.6 果蔬軟化方面的應用

果蔬軟化是在細胞壁多糖降解酶的作用下，細胞壁多糖發(fā)生降解，高聚物解離，細胞壁組織變軟導致肉質軟化。β-半乳糖苷酶可以讓細胞壁的組分不穩(wěn)定，并通過具支鏈的多聚醛酸的降解來溶解果膠，使果蔬軟化。

5 結束語

乳糖酶缺乏或乳糖不耐受是全球面臨的問題，影響了全世界近2/3的人群，對人類的健康造成了很大的威脅。微生物乳糖酶因微生物繁殖快、低生產成本、高酶活力等備受研究者的青睞。目前對微生物乳糖酶的研究主要在于篩選乳糖酶高產菌株，降低乳糖酶生產成本。常溫乳糖酶水解速率慢、酶需要量大，且容易造成牛奶體系的雜菌污染等問題，并且我國乳品生產大多在低溫環(huán)境下進行，因而也促使高產耐熱和耐低溫的乳糖酶生產菌株的開發(fā)，有望解決這些問題。

利用微生物育種技術和現代生物技術發(fā)展乳糖酶基因工程確實可以大大提高乳糖酶產量，但其安全性也有待于進一步提高。為了促進我國乳品工業(yè)的迅速發(fā)展，全面解決乳糖不耐受，開發(fā)高質量且安全的乳糖酶及對乳糖酶生物學特性的研究、探索其規(guī)律性、實現乳糖酶工業(yè)化低成本生產仍是巨大的挑戰(zhàn)。此外，乳糖酶在食品行業(yè)之外的應用也有待進一步發(fā)掘。

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Research progress on microorganism lactase

HE Lu1, LONG Cheng-xing2,4, LIU You-jia2, HUI Hua-ying1, TAN Zhou-jin3*

1(College of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)2(College of Chinese Traditional Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)3(Medical College, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)4(College of Mathematics and Finance, Hunan University of Humanities Science and Technology, Loudi 417000, China)

As a kind of disaccharidase, lactase could decompose lactose into galactose and glucose, and thus applied into dairy production, medical aid digestion, fruit mature softening and environmental protection and so on. As the main source of lactase, microorganism had many characteristics such as fast growing speed, rich enzyme amount, low production cost, and thus was suitable for industrial production. The study of microorganism lactase was mainly focused on the development of lactase-producing microorganisms and application of lactase gene engineering. Herein the research on the characteristics of microorganism lactase, main lactase-producing microorganism, application of engineering to lactase production and the application of microorganism lactase were reviewed.

microorganism; lactase; characteristic; gene engineering

碩士研究生(譚周進教授為通訊作者，E-mail：tanzhjin@sohu.com)。

國家自然科學基金(81573951); 長沙市科技局項目(k1508025-21); 湖南省教育廳項目(16C1202)

2016-12-31，改回日期：2017-02-21

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706046