陳安特，張文娟，張羲，吳秋昊，高鴻，賈利蓉

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都，610065)

釀酒酵母對蘿卜泡菜發(fā)酵過程的影響

陳安特，張文娟，張羲，吳秋昊，高鴻，賈利蓉*

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都，610065)

以櫻桃蘿卜為原料，設(shè)置4個試驗組，分別為乳酸菌接種發(fā)酵組、乳酸菌與酵母菌混合接種發(fā)酵組、酵母菌接種發(fā)酵組和自然發(fā)酵組。對各試驗組發(fā)酵過程中pH值、總酸、亞硝酸鹽、色度、硬度、感官品質(zhì)、乳酸菌數(shù)量、酵母菌數(shù)量及大腸菌群數(shù)量進行研究。實驗結(jié)果表明：在櫻桃蘿卜發(fā)酵過程中，接種釀酒酵母能夠阻止發(fā)酵后期pH進一步下降，降低總酸生成量，抑制泡菜過度酸化，使泡菜保持較高的脆度，并且產(chǎn)生濃郁的酯香風(fēng)味；釀酒酵母的加入不改變亞硝酸鹽消長規(guī)律，也不影響接種乳酸菌對大腸菌群的抑制效果；但在發(fā)酵后期，加入釀酒酵母的試驗組，其乳酸菌的生長受到一定程度的抑制，因此釀酒酵母的使用量還需進一步研究。

釀酒酵母；四川泡菜；發(fā)酵過程；微生態(tài)

傳統(tǒng)四川泡菜生產(chǎn)通常采用自然發(fā)酵方式，將蔬菜浸泡于濃度為5%～10%的食鹽溶液中，利用天然附著在蔬菜表面的微生物(包括乳酸菌、酵母菌和醋酸菌)，經(jīng)以乳酸發(fā)酵為主、兼有酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等過程，產(chǎn)生有機酸、酮、醛、酯等風(fēng)味物質(zhì)，形成獨特的風(fēng)味和口感[1]。由于原料產(chǎn)地的土壤和氣候以及采收季節(jié)不同，發(fā)酵微生物區(qū)系各不相同，自然發(fā)酵泡菜品質(zhì)難以保持穩(wěn)定。因此，近20年來，食品科學(xué)家們從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離、培養(yǎng)乳酸菌，制備成直投式乳酸菌劑，以期實現(xiàn)泡菜的接種發(fā)酵，從而使泡菜品質(zhì)保持穩(wěn)定[2]。直投式乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)四川泡菜縮短了生產(chǎn)周期，保持了產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，并且能阻止發(fā)酵過程形成亞硝酸鹽峰值[3-5]。另一方面，由于直投式乳酸菌劑菌種單一，發(fā)酵后泡菜風(fēng)味不及自然發(fā)酵風(fēng)味柔和、豐富[6]。因此多菌種協(xié)同發(fā)酵成為近年來學(xué)者關(guān)注的熱點，但目前的研究幾乎都局限于多種乳酸菌協(xié)同發(fā)酵對泡菜品質(zhì)的影響，而對于酵母菌的研究較少。事實上，在泡菜發(fā)酵過程中，酵母菌也起到了重要的作用。酵母菌通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生酒精，既可以增加醇香，也可以抑制有害菌生長，還可以進一步與有機酸反應(yīng)產(chǎn)生酯類等芳香成分，使泡菜風(fēng)味更加豐富[7]。此外，酵母菌的代謝產(chǎn)物有利于乳酸菌的生長[8-11]。本研究采用乳酸菌、釀酒酵母接種發(fā)酵四川泡菜，研究兩者協(xié)同發(fā)酵對泡菜品質(zhì)的影響，以及酵母菌與乳酸菌在發(fā)酵過程中的生物演替規(guī)律，為多菌種協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)四川泡菜奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃蘿卜：購于成都市農(nóng)貿(mào)市場。

酵母菌菌粉：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，美國Fleischmann公司。

乳酸菌菌粉：含有植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，美國The Raw Diet Health Shop。

NaOH、亞鐵氰化鉀、醋酸鋅、冰醋酸、硼砂、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、濃HCl、NaNO2：分析純，成都市科龍化工試劑廠；MRS瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1240型紫外可見光分光光度計，北京華運安特科技有限責(zé)任公司；TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systerms公司；CM-5分光測色儀，日本柯尼卡美能達公司；LaboGene Scanspeed1736R 高速冷凍離心機，丹麥LaboGene公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡菜制作方法

設(shè)置4個試驗組，分別為乳酸菌接種發(fā)酵(L組)、乳酸菌與酵母菌混合接種發(fā)酵(LY組)、酵母菌接種發(fā)酵(Y組)和自然發(fā)酵(S組)。按照食鹽濃度72 g/L和蔗糖濃度36 g/L配制泡菜水，高溫滅菌(121 ℃，15 min)后備用。L組添加1.6 g/L乳酸菌菌粉，LY組分別添加1.6 g/L乳酸菌菌粉和0.4 g/L酵母菌菌粉，Y組添加0.4 g/L酵母菌菌粉，S組不添加任何發(fā)酵劑。菌粉稱取后置于100 mL離心管中，加20 mL無菌溫水充分溶解混勻，靜置10～15 min后加入泡菜水中。櫻桃蘿卜洗凈后切片，厚度為0.5 cm。稱取櫻桃蘿卜1 000 g，泡菜水1 250 g，裝入泡菜壇，置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.3.2 理化性質(zhì)測定方法

于0、1、2、3、4、5、10、15、20天測定泡菜的pH、總酸度、亞硝酸鹽含量、色度及硬度。取20 mL泡菜水，在14 000 r/min下離心15 min，取上清液用pH計測定pH值?？偹岫炔捎秒娢坏味ǚy定[12]。亞硝酸鹽含量采用鹽酸-萘乙二胺分光光度法測定[13]。取30 mL泡菜水，在14 000 r/min下離心15 min，取上清液用分光測色儀測定色度。采用質(zhì)構(gòu)儀的剪切模式測定蘿卜片的硬度，探頭下降速度2 mm/s，剪切速度2 mm/s，剪切距離10 mm，重復(fù)測試5次，取平均值。

1.3.3 微生物菌落計數(shù)方法

于0、2、4、6、8、10、15、20天測定泡菜中的乳酸菌總數(shù)、酵母菌總數(shù)和大腸菌群總數(shù)。乳酸菌總數(shù)參照《GB 4789.35—2010 食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》。酵母菌總數(shù)參照《GB 4789.15—2010 食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》。大腸菌群總數(shù)參照《GB 4789.3—2010 食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》。

1.3.4 感官評價方法

選取10名有經(jīng)驗的評員，采用簡單描述評定法[14]對泡菜的氣味、酸度、顏色進行評價，選取出現(xiàn)頻率較高的描述語。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母對櫻桃蘿卜發(fā)酵過程中理化性質(zhì)的影響

2.1.1 發(fā)酵過程中pH和總酸的變化

由圖1可知，發(fā)酵過程中，各試驗組pH均呈現(xiàn)先減小然后平穩(wěn)的趨勢。L組和LY組在0～2天pH分別迅速下降至pH3.72和pH3.81；第2～5天pH下降較為緩慢；第5天后，LY組pH降至pH3.41，保持穩(wěn)定；而L組繼續(xù)下降至pH3.20，10天后保持穩(wěn)定。S組在發(fā)酵第2天為pH4.34，遠高于L組和LY組；發(fā)酵10 d后pH降至pH3.37，然后保持穩(wěn)定。Y組在0～3 d內(nèi)pH下降至pH3.89，3 d后保持穩(wěn)定。由圖2可見，總酸度的變化與pH有類似的規(guī)律，L組和S組在發(fā)酵5 d后總酸度繼續(xù)升高，而LY組和Y組則升高緩慢。對pH和總酸度的分析可知，加入釀酒酵母能夠在發(fā)酵后期阻止泡菜的pH下降，減少總酸生成量，為有效解決泡菜過度酸化的問題提供了新的思路。Van Thi Thuy Ho[15]等人的研究表明，在可可豆發(fā)酵過程中，如果添加納他霉素抑制酵母菌生長，會導(dǎo)致發(fā)酵成品pH值進一步降低，成品過度酸化。該研究結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。

圖1 發(fā)酵過程中pH的變化Fig.1 Change of pH during fermentation

圖2 發(fā)酵過程中總酸度的變化Fig.2 Change of total acid during fermentation

2.1.2 發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

由圖3可知，在整個發(fā)酵周期中，L組、LY組和Y組的亞硝酸鹽含量持續(xù)處于極低的水平，不超過1 mg/kg，遠遠低于國家標準20 mg/kg；這3個試驗組在發(fā)酵2 d后pH均降至4以下，因此雜菌的生長受到抑制，使得亞硝酸鹽無法大量生成并積累[16]。S組在發(fā)酵第3天出現(xiàn)明顯的“亞硝峰”，峰值為17.87 mg/kg；發(fā)酵第4天迅速下降至0.15 mg/kg。自然發(fā)酵過程中，在發(fā)酵初期，由于蔬菜表面附著一些含有硝酸鹽還原酶的細菌，將蔬菜中的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，使得泡菜水中亞硝酸鹽逐漸積累，含量增加。隨著發(fā)酵的進行，乳酸菌大量繁殖，成為優(yōu)勢菌種，產(chǎn)生大量乳酸，pH值下降，從而抑制雜菌生長，硝酸鹽還原酶活性減弱，亞硝酸鹽產(chǎn)生量下降；同時，已經(jīng)產(chǎn)生的亞硝酸鹽可被乳酸菌分泌的亞硝酸鹽還原酶和乳酸降解[17]。

圖3 發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Change of total nitrite content during fermentation

2.1.3 發(fā)酵過程中顏色的變化

蘿卜表皮中富含花青素[18]，是一種水溶性色素，在酸性條件下呈紅色。在發(fā)酵過程中花青素會逐漸轉(zhuǎn)移到泡菜水中，使泡菜水和蘿卜片呈現(xiàn)均勻的紅色。本試驗采用L*a*b*色空間對蘿卜片的紅色進行描述，a*值越大，表明紅色越深。由圖4可知，L組和LY組在發(fā)酵0～3 d，a*值迅速上升，第5天后幾乎不再變化；S組在發(fā)酵10 d后a*值保持穩(wěn)定，大小介于L組和LY組之間；Y組第5天后a*值保持穩(wěn)定，遠低于其他試驗組。結(jié)合泡菜pH變化的分析，在酸性環(huán)境中，泡菜顏色可能與蘿卜表皮中色素溶出量有一定關(guān)系：pH越低，色素溶出量越高，泡菜顏色越深。加入釀酒酵母不影響櫻桃蘿卜發(fā)酵過程中的顏色變化。

圖4 發(fā)酵過程中顏色的變化Fig.4 Change of color during fermentation

2.1.4 發(fā)酵過程中硬度的變化

由圖5可知，各試驗組在發(fā)酵4 d后，蘿卜片硬度均明顯下降。發(fā)酵后期，LY組和Y組的硬度均大于L組和LY組。泡菜發(fā)酵過程中，隨著pH下降，有機酸逐漸累積，原料中果膠在酸的作用下逐漸水解為果膠酸，細胞之間粘結(jié)性降低，從而導(dǎo)致蘿卜片硬度下降[19]。發(fā)酵后期LY組和Y組總酸度均大于L組和S組，因此其蘿卜片中果膠酸降解程度較低，從而保持較高的硬度。

圖5 發(fā)酵過程中硬度的變化Fig.5 Change of hardness during fermentation

2.2 釀酒酵母對櫻桃蘿卜發(fā)酵過程中微生態(tài)的影響

2.2.1 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量的變化

由圖6可知，在發(fā)酵初期，各試驗組乳酸菌數(shù)量均有不同程度的增長，同時在第4天達到最大值，L組、LY組和S組均在107CFU/mL以上，而Y組則在106～107CFU/mL之間。之后L和S組中的乳酸菌數(shù)量基本保持穩(wěn)定至第10天，然后緩慢下降；LY組和Y組則在第4天達到最大值后緩慢下降。導(dǎo)致LY組和Y組的乳酸菌數(shù)量過早下降的原因可能是釀酒酵母進行酒精發(fā)酵，使發(fā)酵體系酒精濃度過高，抑制了乳酸菌生長。李愛霞、秦偉帥等[20-21]的研究表明一定濃度的酒精會抑制乳酸菌的新陳代謝，甚至造成乳酸菌死亡。

圖6 發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量的變化Fig.6 Change of the colony counts of LAB during fermentation

2.2.2 發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量的變化

由圖7可知，發(fā)酵過程中，L組和S組的酵母菌數(shù)量呈先增加后減少的趨勢，發(fā)酵2 d數(shù)量達到最大，分別為102.7CFU/mL和104.3CFU/mL，之后迅速減少，第4天后無法檢出。整個發(fā)酵過程中，LY組和Y組的酵母菌數(shù)量持續(xù)減少，LY組在10 d后無法檢出，Y組酵母菌數(shù)量在發(fā)酵結(jié)束時為103.5CFU/mL。顯著性差異分析結(jié)果表明，發(fā)酵第2天，L組和S組酵母菌數(shù)量具有顯著性差異(P<0.05)，S組明顯大于L組，說明接種乳酸菌抑制了原料自身附著的酵母菌的生長，從而導(dǎo)致風(fēng)味成分較自然發(fā)酵單薄。

圖7 發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量的變化Fig.7 Change of the colony counts of yeast during fermentation

2.2.3 發(fā)酵過程中大腸菌群數(shù)量的變化

由圖8可知，隨著發(fā)酵的進行，各試驗組的大腸菌群數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后減少直至消失的趨勢。L組和LY組中，大腸菌群在第2天達到最大值，分別為103.3CFU/mL和103.5CFU/mL，第4天后檢測不到。S組中，發(fā)酵前第0～4天大腸菌群數(shù)量一直在增長，第4天上升到最大值103.3CFU/mL后迅速下降，第6天后沒有檢出。Y組中，大腸菌群在第2天達到最大值103.8CFU/mL，然后逐漸下降，第8天后檢測不到。對比各試驗組大腸菌群數(shù)量變化可發(fā)現(xiàn)，單獨接種乳酸菌、同時接種乳酸菌和釀酒酵母均可明顯抑制大腸菌群的生長，結(jié)合泡菜pH變化分析可知，發(fā)酵過程中pH降低越快，大腸菌群受抑制程度越強。乳酸菌對大腸桿菌具有抑制作用，并且環(huán)境pH越低，抑制效果越好，與本實驗結(jié)果一致[22-24]。

圖8 泡菜水中大腸菌群數(shù)量的變化Fig.8 Change of the colony counts of coli-group during fermentation

2.3 釀酒酵母對櫻桃蘿卜發(fā)酵過程中風(fēng)味品質(zhì)的影響

感官評定結(jié)果表明(表1)，發(fā)酵過程中，L組產(chǎn)生刺激性酸味，風(fēng)味較單一，缺乏酯香味，不及LY組和S組酸味柔和、風(fēng)味醇厚。乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵相對于乳酸菌單獨發(fā)酵在風(fēng)味和泡菜顏色上表現(xiàn)更佳[25]。

表1 感官評定

3 結(jié)論與討論

在櫻桃蘿卜發(fā)酵過程中，接種釀酒酵母能夠阻止其pH進一步下降，降低總酸生成量，可有效解決泡菜過度酸化的問題，從而使泡菜保持較高的脆度；并且使泡菜產(chǎn)生酯香風(fēng)味，整體風(fēng)味更加醇厚。此外，釀酒酵母的加入不會改變櫻桃蘿卜泡菜原有的色澤，不影響其亞硝酸鹽消長規(guī)律，也不會改變接種乳酸菌對大腸菌群的抑制效果。

在乳酸菌純種發(fā)酵泡菜過程中，接種的乳酸菌會抑制原料自身的酵母菌的生長，影響泡菜風(fēng)味的醇厚感，所以在接種發(fā)酵泡菜中有必要添加增香酵母菌。另一方面，接種酵母菌會產(chǎn)生酒精發(fā)酵，生成大量酒精及其他代謝產(chǎn)物，使得泡菜在發(fā)酵前期出現(xiàn)酒糟味，并且酒精的積累可能會導(dǎo)致乳酸菌生長受到抑制，因此對酵母菌的添加量有待進一步研究。

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Effects ofSaccharomycescerevisiaeon pickled radishes during fermentation

CHEN An-te,ZHANG Wen-juan,ZHANG Xi,WU Qiu-hao,GAO Hong,JIA Li-rong*

(College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Cherry radishes were pickled into four groups: lactic acid bacteria (LAB) inoculated fermentation, LAB andSaccharomycescerevisiaemix-inoculated fermentation,Saccharomycescerevisiaeinoculated fermentation and spontaneous fermentation groups. Total acid, pH, nitrite content, chrominance, hardness, sensory quality, the colony counts of LAB, yeast and coli-group were monitored during the fermentation process of Cherry radishes. The results indicated that inoculatingSaccharomycescerevisiaecould decrease the generation of total acid, thereby inhibit a further drop in pH values during fermentation, and thus prevent the over-acidification and maintain the high brittleness of pickled cherry radishes, as well as produce a strong aroma of ester. The growth and decline rule of nitrite content and inhibitory effect of LAB toward coliform won’t be changed by inoculation ofSaccharomycescerevisiae. However, the usage ofSaccharomycescerevisiaeneeds to be further investigated because the growth of LAB was relatively inhibited in experimental groups withSaccharomycescerevisiae.

Saccharomycescerevisiae; Sichuan Paocai; fermentation process; microecology

碩士研究生(賈利蓉副教授為通訊作者，E-mail：771441479@qq.com)。

2017-01-11，改回日期：2017-02-08

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706021