古麗巴哈·買買提++++++劉玉++++++趙莉++++++嚴媚

[摘要] 目的 探討1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]對人白血病6T-CEM細胞株凋亡及維生素D受體（VDR）蛋白表達的影響。 方法 培養(yǎng)6T-CEM細胞株，采用隨機數(shù)字表法將其分為A、B、C、D四組，A、B、C組分別加入濃度為10-6、10-7、10-8 mol/L的1，25（OH）2D3，D組加入DMSO。采用MTT法檢測各組吸光度A值和細胞增殖抑制率情況，AO-EB熒光染色觀察各組細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，RT-PCR和Western blot法檢測VDR mRNA和蛋白表達。 結(jié)果 A組吸光度A值明顯低于B、C組和D組（P < 0.05）；A、B、C三組的細胞增殖抑制率從高到低依次排序為A>B>C；D組CEM細胞凋亡指數(shù)明顯低于A、B、C組（P < 0.05）；A組凋亡指數(shù)明顯高于其他三組（P < 0.05）；各組VDR mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；A組VDR蛋白表達明顯高于其他三組（P < 0.05）。 結(jié)論 1，25（OH）2D3能有效抑制6T-CEM細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，上調(diào)VDR蛋白表達。

[關(guān)鍵詞] 白血?。?T-CEM細胞株；1，25-二羥維生素D3；維生素D受體

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of 1， 25-dihydroxyvitamin D3 [1， 25 （OH）2D3] on apoptosis of 6T-CEM cell lines and expression of vitamin D receptor （VDR） protein human leukemia. Methods The 6T-CEM cell lines were cultured and randomly divided into group A， B， C， D. Group A， B， C were added with 1， 25 （OH）2D3 with the concentration of 10-6， 10-7， 10-8 mol/L respectively， and group D was added with DMSO. The absorbance A value and cell proliferation inhibition rate were detected by MTT method， the cell morphology was observed by AO-EB fluorescence staining， and the cell apoptosis was detected by flow cytometer， the expression of VDR mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot method. Results The absorbance of group A was apparently lower than that of group B， C and D （P < 0.05）； the inhibitory rate of cell proliferation of group A， B， C was A>B>C； the CEM cell apoptosis index of group D was apparently lower than that of group A， B and C （P < 0.05）； the apoptosis index of group A was apparently higher than other three groups （P < 0.05）； there was no statistically significant difference in VDR mRNA expression among the four groups （P > 0.05）. The VDR protein expression of group A was apparently higher than that of other three groups （P < 0.05）. Conclusion 1， 25 （OH）2D3 can effectively inhibit the proliferation of 6T-CEM cells， induce its apoptosis， up-regulate the VDR protein expression.

[Key words] Leukemia； 6T-CEM cell lines； 1， 25-dihydroxyvitamin D3； Vitamin D receptor

白血病是一種惡性的造血干細胞克隆性疾病，也是目前最為常見和最具威脅的血液系統(tǒng)疾病[1-2]。該病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，一般認為與多個基因的調(diào)控異常有關(guān)[3]。目前臨床上多采用基因靶向藥物治療慢性粒細胞白血病，雖然取得了一定的效果，但其分子靶點具有一定的局限性，對一些急變期慢性粒細胞白血病患者的治療效果較差[4-5]。1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]是維生素D在機體中主要的活性產(chǎn)物，不但具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝平衡的作用，還能誘導(dǎo)腫瘤細胞分化并抑制腫瘤細胞增殖，其目前是腫瘤研究的熱點之一[6-7]。本研究選取人白血病6T-CEM細胞株作為研究對象，探討分析了1，25（OH）2D3對人白血病6T-CEM細胞株凋亡及維生素D受體（VDR）蛋白表達的影響，為臨床上尋找更好的分子靶點治療白血病提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人急性T淋巴細胞白血病細胞株6T-CEM由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所提供，置于-80℃冰箱中保存。培養(yǎng)方法如下：將菌株取出后于37℃迅速融化，以1000 r/min離心（離心半徑為3 cm）5 min后棄上清液，利用培養(yǎng)液洗滌后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行重懸，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天換液并傳代1次。

1.2 實驗分組

將CEM細胞懸液密度調(diào)整為2.0×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，采用隨機數(shù)字表法將實驗分為A、B、C、D四組，A、B、C組分別加入以DMSO稀釋的濃度為10-6、10-7、10-8 mol/L的1，25（OH）2D3各100 μL，D組加入100 μL DMSO，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 MTT檢測細胞增殖

取各組細胞懸液加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h，隨后加入DMSO進行溶解并沉淀，利用酶標儀在490 nm波長測定各孔的吸光值（A），每組實驗重復(fù)3次。細胞增殖抑制率=（對照孔平均OD值-用藥孔平均OD值）/對照孔平均OD值×100%，實驗重復(fù)3次。

1.4 AO-EB染色觀察細胞形態(tài)

取各組細胞懸液加吖啶橙和溴化乙啶（AO-EB）染液進行復(fù)合染色，并于3 min內(nèi)以熒光顯微鏡（Axioskop40，德國Zesis公司）進行觀察，發(fā)射波長分別為紅色熒光（600 nm）和綠光（550 nm），每個視野內(nèi)隨機計數(shù)200個細胞來計算細胞凋亡指數(shù)，公式如下：細胞凋亡指數(shù)（%）=（早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞）/全部細胞×100%，每組實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將各組細胞懸液以PBS洗滌后再加入體積分數(shù)為0.7的乙醇4℃固定過夜，加入20 μg/mL的RNase，37℃條件下處理30 min，過濾后加入5 μL AnnexinV-FITC和100 μg/mL的PI染液染色30 min，最后以流式細胞儀（FACSCalibur，BD公司）進行檢測。

1.6 RT-PCR檢測VDR mRNA表達

將各組細胞懸液以RNA提取試劑盒提取總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，隨后利用RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，7900FS）定量檢測VDR mRNA的表達情況，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國Epitomics公司，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 Western blot檢測VDR蛋白表達

將各組細胞抽提蛋白后取約50 μg于聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，2 h后轉(zhuǎn)移至聚亞乙烯雙氧化物膜上，5%脫脂奶粉孵育過夜。先加入1∶1000的一抗（Anti-VDR Ab）稀釋液于4℃條件下孵育過夜，再加入1∶5000的二抗（HRP標記的羊抗鼠IgG）稀釋液于室溫下孵育1 h，加入電化學(xué)分析劑后暗室顯影和定影，采用軟件進行灰度值分析，計算VDR蛋白與β-actin的灰度比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)整理分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEM細胞的MTT檢測情況

A組的吸光度A值明顯低于B、C、D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。A、B、C三組的細胞增殖抑制率從高到低依次排序為A>B>C。見表1。

2.2 CEM細胞形態(tài)特征

AO-EB復(fù)合染色結(jié)果，細胞核或細胞漿呈致密濃染或碎片呈黃綠色熒光者即為凋亡細胞，同時細胞核呈紅色熒光者即為壞死細胞?？梢夾組正常細胞少見，B組正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞并存，C組可見少數(shù)凋亡細胞，D組細胞大小形態(tài)均一，胞核及胞漿呈均勻黃綠色熒光。見圖1（封三）。

2.3 CEM細胞凋亡情況

A組CEM細胞凋亡指數(shù)為（41.23±4.10）%，B組為（30.05±2.84）%，C組為（24.38±1.46）%，D組為（11.50±0.07）%，四組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。其中A、B、C組分別與D組比較，t = 13.283、10.382和9.894，P < 0.05；A、B組分別與C組比較，t = 11.034、7.382，P < 0.05；A組與B組比較，t = 9.372，P < 0.05。見圖2（封三）。

2.4 VDR mRNA和蛋白表達情況

各組VDR mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。A組VDR蛋白表達明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2、圖3～4。

3 討論

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，主要是指克隆性白血病細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等，并在骨髓和其他造血組織中大量累積，浸潤其他非造血組織和器官，進而抑制正常造血功能的疾病，患者的臨床表現(xiàn)多為不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛等[8-10]。我國白血病的發(fā)病率較高，在各種腫瘤中占第6位，發(fā)病原因分為病毒、化學(xué)、放射、遺傳等因素，臨床上多依據(jù)起病的緩急分為急性和慢性白血病兩種。目前臨床上并沒有統(tǒng)一的治療方式，常用的方法有化學(xué)治療、放射治療、靶向治療、免疫治療、干細胞移植等，且已取得了良好的治療效果，患者的預(yù)后得到了明顯的改善[11]。但同時也有研究表明[12]，大劑量化療藥物治療雖然能改善患者的癥狀，但長期用藥的不良反應(yīng)較大，患者的依從性也較差，因此尋找新的、特異性高、不良反應(yīng)小的藥物是目前醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點和難點。近年來，1，25（OH）2D3抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的作用備受關(guān)注，已有不少學(xué)者將1，25（OH）2D3應(yīng)用于腸癌、乳腺癌細胞、急性髓性白血病等的治療過程中，并取得了一定的效果[13-16]。1，25（OH）2D3是人體必需維生素，又稱為骨化三醇，也是維生素D在人體內(nèi)的活化形式，其不但可以維持體內(nèi)鈣環(huán)境相對穩(wěn)定，還可調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、分化。為了進一步探討其作用機制，本研究選取人白血病6T-CEM細胞株作為研究對象，探討分析不同濃度的1，25（OH）2D3對人白血病6T-CEM細胞株凋亡及VDR和蛋白表達的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A、B、C組測得吸光度A值均明顯低于D組，且A組最低；計算細胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn)，A、B、C組細胞增殖抑制率分別為63.53%、27.27%和7.03%，提示1，25（OH）2D3對人白血病6T-CEM細胞的增殖具有一定的抑制作用，且隨著1，25（OH）2D3濃度的升高，抑制作用則明顯提升。將各組細胞進行染色后觀察發(fā)現(xiàn)，A組內(nèi)幾乎全為凋亡和壞死細胞，而B組內(nèi)正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞并存，C組僅有少量凋亡細胞，D組內(nèi)幾乎全為正常細胞，提示1，25（OH）2D3具有誘導(dǎo)人白血病6T-CEM細胞株凋亡的作用，且隨著濃度的提升，誘導(dǎo)作用明顯加強，而各組CEM細胞凋亡情況也進一步證實了這一結(jié)論。本研究中，D組CEM細胞凋亡指數(shù)明顯低于A、B、C組，而A組凋亡指數(shù)為明顯高于其他三組。但本研究同時發(fā)現(xiàn)，添加1，25（OH）2D3濃度最高的A組的凋亡指數(shù)也僅為（41.23±4.10）%，細胞增殖抑制率僅為63.53%，提示單用1，25（OH）2D3的療效較小，將1，25（OH）2D3與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可能會提高療效，但具體結(jié)果需做進一步的深入研究。

有研究表明[17]，1，25（OH）2D3對腫瘤的調(diào)節(jié)作用主要是通過VDR來實現(xiàn)的，其與VDR特異性結(jié)合后可促進VDR與視黃醛酸受體結(jié)合形成復(fù)合物，并與相應(yīng)基因的啟動子區(qū)域作用元件進行結(jié)合，進而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄活性，而靶細胞對VD反應(yīng)性的差異與VDR蛋白的表達水平相關(guān)。本研究同時發(fā)現(xiàn)，各組VDR mRNA表達差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），但A組VDR蛋白表達為0.612±0.042，明顯高于其他三組，提示不同濃度的1，25（OH）2D3對VDR mRNA表達并無明顯影響，但能調(diào)控VDR蛋白的表達，且隨著濃度的升高，效果更為明顯。

本研究選用人白血病6T-CEM細胞株作為研究對象，對比了不同濃度的1，25（OH）2D3對人白血病6T-CEM細胞株凋亡及VDR和蛋白表達的影響，證實了1，25（OH）2D3能抑制CEM細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與上調(diào)VDR蛋白的表達有關(guān)，這與文獻的研究結(jié)果基本一致[18]。但也有研究表明[19-20]，1，25（OH）2D3誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡與多種基因如C-myc、Bcl-2、TNF等的調(diào)控有關(guān)；本研究限于研究樣本的不足，對于其作用機制仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，1，25（OH）2D3能有效抑制6T-CEM細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，上調(diào)VDR蛋白表達。

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