徐軼爾 于雪峰 陳水林 韓忠麗 孫貴才*

1.哈藥集團(tuán)藥物研究院，黑龍江 哈爾濱 150025 2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，江西 南昌 330003 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis，GA)是由于血液中尿酸增高，尿酸鹽結(jié)晶析出，沉積在滑膜、軟骨、關(guān)節(jié)囊和骨質(zhì)等關(guān)節(jié)組織，引起關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織病理性損傷和炎癥反應(yīng)[1]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的變化，痛風(fēng)患者的比例逐年上升，致殘率和致畸率較高，給人們的生活和健康帶來不便。目前尚無確切的治療方法根治GA，現(xiàn)在主要的治療目的就是及時控制急性發(fā)作，并減低血液中尿酸，減少尿酸鹽沉積，降低關(guān)節(jié)損傷等，臨床上痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作常用秋水仙堿治療，然而秋水仙堿可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟、腎臟和骨髓的損傷[2,3]。因此，尋找一種低毒、高效的治療藥物，仍是GA治療應(yīng)該急需解決的關(guān)鍵問題。

豨薟草味辛、苦、寒，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)和解毒之功效，主要用于治療風(fēng)濕痹癥，關(guān)節(jié)疼痛，筋骨無力，腰膝酸軟等[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)以豨薟草為主藥的復(fù)方豨薟草膠囊能夠明顯降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-1β和IL-6水平、明顯降低炎性因子的釋放，降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄，明顯改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)癥狀[5,6]。以往的研究發(fā)現(xiàn)尿酸鈉結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)后，能夠激活多種信號通路參與GA炎癥的發(fā)生發(fā)展，絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)細(xì)胞信號通路激活白細(xì)胞，誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子等炎性因子的合成和釋放[7]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作為MAPK家族主要成員之一，參與多種生物學(xué)反應(yīng)及疾病的發(fā)生發(fā)展，因此，本實驗以JNK信號通路為基礎(chǔ)，探討痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與JNK信號通路之間的關(guān)系及中藥豨薟草干預(yù)機(jī)制影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物

豨薟草購于哈爾濱市同仁堂大藥房；SP600125(JNK抑制劑)和尿酸鈉(Uric acid sodium salt，U2875-5G) 購自美國Sigma 公司；大鼠白細(xì)胞介素IL-1、白細(xì)胞介素IL-8和腫瘤壞死因子TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒購于美國R&D 公司；JNK和p-JNK購于英國abcam公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 豨薟草提取物制備

將豨薟草藥材40 ℃烘干，粉碎成干粉，然后加入10倍水于80 ℃提取兩次，每次提取30 min。過濾，棄去濾渣，合并濾液，過濾，將溶液濃縮至100 mL，離心2 000 r/min，10 min，取上清液，備用。

1.3 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型建立[8,9]及分組

將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、SP600125組(JNK抑制劑)和豨薟草高(4 g/kg)、中(2 g/kg)、低(1 g/kg)組，各組分別給予生理鹽水或藥物5天，末次給藥1 h后，大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉0.2ml(20 mg/ mL)，對照組膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.2 mL,各組大鼠造模后再繼續(xù)灌胃給藥2天[10]。

1.4 滑膜組織形態(tài)學(xué)檢測

取各組大鼠滑膜組織，4 % 多聚甲醛固定, 梯度乙醇脫水, 二甲苯透明, 浸蠟, 石蠟包埋切片, 二甲苯進(jìn)行脫蠟，梯度濃度的乙醇進(jìn)行水化，Harris蘇木精染色3～5 min，蒸餾水沖洗1 min，75%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，蒸餾水沖洗10 min至細(xì)胞核呈藍(lán)色，0.5%伊紅水溶液1 min，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量測定

采集各組大鼠腹主動脈血液，3 500 r/min，離心15 min，收集血清，按照ELISA試劑盒說明書要求測定TNF-α，IL-1和IL-8含量。

1.6 實時定量PCR檢測滑膜組織中c-Jun、AP-1和NF-κB mRNA表達(dá)

c-Jun、AP-1和NF-κB mRNA引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：c-Jun上游5′-TAC GCTGCCCAGTGTCACCT-3′，下游5′-CGT CTGCGGCTCTTCCTTCA-3′，AP-1上游5′-TGGGCACATCACCACTACA C-3′，下游5′-TCTGGCTATGCAGTTCAGCC-3′, NF-κB上游5′-GCTATGTGTGT GAAGGCCCA-3′，下游5′-TGCAAATTTTGACCTGTGGGT-3′。取各組滑膜組織100 mg，按TRIZOL法提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并應(yīng)用cDNA用于實時定量PCR檢測。

1.7 滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白表達(dá)

取各組滑膜組織100 mg，加入組織裂解液提取滑膜組織總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫孵育2 h后，加入一抗工作液，4 ℃過夜， TBS-T緩沖液洗膜5次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次，10 min/次，采用ECL法顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，在顯微鏡下觀察，對照組滑膜細(xì)胞間彼此排列疏松，滑膜細(xì)胞之間為膠原性間質(zhì)，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組炎癥明顯，炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞增生，成纖維細(xì)胞及小血管增生, 纖維炎性蛋白滲出物；SP600125組和豨薟草高、中、低組炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，滑膜細(xì)胞增生和成纖維細(xì)胞增生明顯減輕，且豨薟草對滑膜組織的炎癥影響呈劑量依賴性。

圖1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織病理變化(HE染色，原始圖片放大100倍)Fig.1 Pathological changes of rat synovial tissue with gouty arthritis (stained with hematoxylin and eosin, original magnification×100)

2.2 大鼠血清中TNF-α，IL-1和IL-8含量測定

如表1所示，與對照組比較，模型組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，SP600125組和豨薟草高、中、低組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎性因子TNF-α，IL-1和IL-8含量明顯降低(P<0.05)，且隨著豨薟草的劑量增加抑制炎性因子的釋放明顯。

組別IL-1(pg/mL)IL-8(pg/mL)TNF-α(pg/mL)對照組145.85±9.42394.22±15.4428.64±0.05模型組1563.62±36.84?589.82±21.37?85.87±0.16?SP600125組1249.11±25.31#458.72±19.64#54.41±0.13#4 g/kgHSG406.81±26.16#429.59±18.55#32.87±0.14#2 g/kgHSG982.43±18.45#467.82±23.49#41.93±0.09#1 g/kgHSG1364.65±27.11#504.88±20.44#59.41±0.12#

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05
Compared with the control group,*P<0.05；compared with the model group,#P<0.05

2.3 滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達(dá)

如表2所示，與對照組比較，模型組滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，SP600125組和豨薟草高、中、低組滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，在一定劑量范圍內(nèi)豨薟草對滑膜組織中c-Jun、AP-1和 NF-κB mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。

組別c-jun/GAPDHAP-1/GAPDHNF-ΚB/GAPDH對照組1±0.091±0.081±0.12模型組8.89±0.57?9.65±0.86?10.62±0.97?SP600125組4.38±0.29#4.62±0.53#4.97±0.33#4 g/kgHSG2.57±0.19#3.61±0.25#3.98±0.31#2 g/kgHSG5.68±0.43#6.05±0.56#6.14±0.49#1 g/kgHSG7.08±0.85#7.26±0.43#7.66±0.52#

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。
Compared with the control group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05.

2.4 滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白表達(dá)

如圖2所示，與對照組比較，模型組滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白的明顯增加(P<0.05)；SP600125組處理后痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白顯著降低(P<0.05)；給予豨薟草高、中、低劑量后痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白明顯降低(P<0.05)，隨著劑量的增加對JNK和p-JNK的影響逐漸增大。

圖2 不同濃度豨薟草對滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白表達(dá)影響Fig.2 Effect of different concentrations of Herba Siegesbeckiae on JNK and p-JNK protein expression in synovial tissue

3 討論

c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase, JNK)是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族主要成員之一。JNK信號通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和惡變以及維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架構(gòu)建等多種生物學(xué)反應(yīng)[11]。JNK信號通路可以被熱休克、氧化損傷、細(xì)胞因子、表皮生長因子等多種因素激活，JNK信號通路功能異常可造成缺血再灌注損傷、慢性炎癥和神經(jīng)退行性病變等多種疾病。研究早期發(fā)現(xiàn)JNK被認(rèn)為是一種特異性激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-jun的活性，提高活化蛋白1(AP-1)的轉(zhuǎn)錄[12]；最近研究發(fā)現(xiàn)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子ELK-1、P53和c-Myc及Bcl2家族(Bcl2、BAD)也是JNK的底物，表明JNK可以直接快速的發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[13-16]。因此，JNK有望成為臨床上的一個潛在的治療靶點，調(diào)節(jié)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究證實痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與炎性因子IL-1、IL-8和TNF-α釋放及其相關(guān)信號通路激活，抗原呈遞細(xì)胞活化，中性粒細(xì)胞凋亡和免疫球蛋白等有關(guān)[17]。其中炎性因子釋放和相關(guān)信號通路異常激活，促進(jìn)炎性因子的釋放過程中NF-κB是炎性因子自分泌或/和旁分泌的中心環(huán)節(jié)，JNK對運行炎癥的機(jī)制發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用，因此，本研究以痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為研究基礎(chǔ)，研究不同濃度的豨薟草提取物和JNK信號通路抑制劑SP600125痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎性因子IL-1、IL-8、TNF-α和NF-κB影響，研究發(fā)現(xiàn)模型組中大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量明顯增加，滑膜組織中NF-κB的表達(dá)明顯增加，灌胃給予不同濃度的豨薟草提取物和JNK抑制劑SP600 125發(fā)現(xiàn)大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量明顯降低，滑膜組織中NF-κB的表達(dá)明顯降低，并且結(jié)合病理學(xué)結(jié)果可知模型組滑膜組織中滑膜細(xì)胞增生、成纖維細(xì)胞增生和炎癥明顯；給予不同濃度的豨薟草和JNK抑制劑SP600125炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，滑膜細(xì)胞增生和成纖維細(xì)胞增生明顯減輕，表明豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠明顯改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀的發(fā)生發(fā)展和炎性因子的釋放。

JNK信號通路的激活與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)明顯增加，c-Jun、AP-1mRNA水平表達(dá)明顯升高，說明痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎激活JNK信號通路，給予不同濃度的豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠明顯降低JNK、p-JNK、c-Jun mRNA和AP-1 mRNA表達(dá)水平。

綜上所述，以痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為研究對象，通過觀察不同濃度豨薟草與JNK抑制劑SP600125對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α含量變化和滑膜組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1、IL-8、TNF-α水平，降低滑膜組織中炎性因子的釋放和浸潤，改善炎癥反應(yīng)，同時研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中JNK和p-JNK蛋白及c-Jun mRNA和AP-1 mRNA表達(dá)增加，豨薟草和JNK抑制劑SP600125能夠明顯降低JNK和p-JNK蛋白和c-Jun mRNA和AP-1 mRNA表達(dá)，結(jié)果表明豨薟草能夠明顯改善痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠炎性反應(yīng)和滑膜組織損傷，可能的機(jī)制是通過改善JNK通路的異常激活，降低JNK通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，因此，豨薟草有望作為JNK信號通路抑制劑成為治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物。