楊 影，曲 超

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

過氧化氫誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化損傷模型的建立

楊 影，曲 超

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

目的 探討視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化損傷模型的構(gòu)建方法。方法將培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分為對照組和實驗組，實驗組加入50、100、200、300、400 μmol/LH2O2，對照組不加入H2O2，采用MTT法檢測細胞活力，在培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h，采用CCK-8檢測細胞抑制率，用比色法觀察每組中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量的變化，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果人RPE細胞經(jīng)200 μmol/LH2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細胞的活力、抗氧化物酶SOD活性均出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)，MDA含量均有顯著升高(P＜0.01)，細胞凋亡率較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論200 μmol/LH2O2作用處理人視網(wǎng)膜色素上皮細胞是體外模擬視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化損傷的良好模型。

過氧化氫;視網(wǎng)膜色素上皮細胞;氧化損傷

【Key words】Hydrogen peroxide;Retinal pigment epithelial cells;Oxidative damage

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)又稱為老年性黃斑變性(senile macular degeneration，SMD)，在臨床上既是常見病又是難治性疾病，常常引起患者視力下降甚至失明，且發(fā)病有逐年增加的趨勢。關(guān)于AMD的病因尚未完全明了，有研究表明人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)的氧化損傷在年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病和病程發(fā)展中起重要的作用，RPE抗氧化損傷的研究將對AMD等視網(wǎng)膜疾病的治療開闊新的前景。

氧化應激是指細胞暴露于活性氧而引起的細胞損傷，過氧化氫(H2O2)是一類活性氧，其極易透過細胞膜與細胞內(nèi)的鐵離子(Fe2+)通過Fenton反應產(chǎn)生很高活性的羥自由基(·OH)，攻擊細胞結(jié)構(gòu)從而引起細胞損傷［1］，但這種損傷不會造成細胞死亡，而且在適宜的保護劑作用下，這些損傷還有可能被修復［2］。由于H2O2易于獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，所以其已成為研究細胞氧化損傷的重要工具。因此，本研究2015年1月至2016年5月以RPE細胞為研究對象，以H2O2為氧化損傷誘導劑，建立一種可靠的體外模擬氧自由基誘導細胞氧化損傷模型，旨在為后續(xù)研究氧化損傷的機制以及抗氧化應激藥物的篩選提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407細胞系由四川省人民醫(yī)院分子遺傳中心實驗室提供，H2O2溶液(購自美國 Sigma Aldrich公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(購自美國 GIBCO公司)，MTT試劑盒、CCK-8試劑盒(購自美國 Sigma公司)，總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(購自中國LEAGENE公司，)丙二醛(MDA)測試盒(購自南京建成生物技術(shù)有限公司)，流式細胞檢測儀(美國Becton Dicknson)，Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒(美國BD公司)，超凈工作臺 (購自蘇州凈化設備有限公司)，細胞培養(yǎng)箱(購自美國Shellab公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞復蘇與培養(yǎng) 遵守快融的原則，先將水浴鍋調(diào)至37～37.5℃，從-80℃冰箱或者液氮罐里拿出人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凍存管迅速投入37℃溫水中，并輕輕搖動使其內(nèi)容物迅速融化(最好在1min以內(nèi))，取出凍存管，微微上下晃動凍存管，用75%酒精消毒后開啟，用吸管吸出溶解后的細胞懸液，注入離心管并加入5 ml的含10%胎牛血清(FBS)的細胞培養(yǎng)液。以800～1000 rpm離心5 min，除去上清液，加入1 ml培養(yǎng)液吹打，使其形成懸浮液。用含20%FBS的細胞培養(yǎng)液適當稀釋后，調(diào)整細胞濃度為50×106/ml接種到25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2d換液1次，細胞近鋪滿(80%～90%)時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的人RPE傳代細胞接種于6孔板及96孔板中。

1.2.2 H2O2濃度的篩選 將細胞按濃度1×106/ml接種于96孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后分別加入0、50、100、200、300、400 μmol/L(n=6)H2O2，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，每孔加入 20 μL 5 mg/ml MTT，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6小時，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值(A490)。細胞抑制率(%)=［A(對照組)-A(實驗組)］/A(對照組)×100%，篩選出合適的H2O2濃度。

1.2.3 CCK-8檢測細胞抑制率 收集生長良好的人RPE細胞，調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，同步化后分成正常對照組和氧化損傷組，將200 μmol/L的H2O2加入細胞培養(yǎng)液中，將細胞置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2、8、24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4小時。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.4 抗氧化物酶SOD活性檢測 細胞處理及分組如1.2.3，收集細胞培養(yǎng)液，加入300 μl試劑A冰浴勻漿，4℃，10000 g離心10 min，收集上清，按照每個反應1.6 ml的體積，均勻混合1 mlSOD檢測緩沖液、0.3 mlNBT顯色液、0.3 ml酶溶液，加入反應啟動工作液后充分混勻。取空白對照管置于暗處，其他各管置于4000Lx日光下反應20 min。，以不照光的空白對照管調(diào)零，用紫外分光光度計，比色杯光徑為1 cm，檢測560 nm處吸光度值。

1.2.5 MDA含量測定 細胞處理及分組同1.2.3，細胞處理結(jié)束后消化、離心收集細胞，按南京建成生物工程研究所提供的相應試劑盒說明書，用酶標儀測定530 nm處的吸光值(A530)。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 細胞處理及分組同1.2.3，細胞處理結(jié)束后消化、離心收集細胞，加入Annexin V-FITC結(jié)合液，采用Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒檢測，計算細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和Turkey's多因素t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度H2O2處理對人RPE細胞活力的影響由表1可見，H2O2處理后細胞活力降低，細胞數(shù)量減少，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，H2O2的濃度越高，細胞存活率越低，細胞抑制率越高，當H2O2濃度為 50、100 μmol/L，細胞存活率高于 70%，當 H2O2濃度為 300、400 μmol/L，細胞存活率低于 30%，細胞形態(tài)破壞嚴重，存活細胞過少，不宜造模;當H2O2濃度為200 μmol/L，抑制率在53.20%時，損傷相對適中，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，故后續(xù)試驗選擇200 μmol/LH2O2作為細胞氧化損傷的最佳濃度。

表1 不同濃度H2O2處理對人RPE細胞活力的影響

2.2 CCK-8檢測不同作用時間H2O2對人RPE細胞活力的影響人RPE細胞經(jīng)200 μmol/LH2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細胞的活力均出現(xiàn)極顯著降低(P＜0.01)，而且與時間成依賴性，時間越長，活力越低，見表2。

表2 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細胞活力的影響

2.3 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細胞抗氧化物酶SOD活性的影響人RPE細胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細胞抗氧化物酶SOD活性均出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05)，見表3。

表3 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細胞抗氧化物酶SOD活性的影響

2.4 200 μmol/L H2O2處理對人 RPE細胞 MDA含量的影響人RPE細胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細胞MDA含量均有顯著升高(P＜0.01)，見表4。

表4 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細胞MDA含量的影響

2.5 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細胞凋亡率的影響人RPE細胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較，細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與時間成依賴性，見表5。

表5 200 μmol/L H2O2處理對人RPE細胞凋亡率的影響 (%)

3 討論

RPE細胞的損傷、衰老及死亡在AMD發(fā)病和病程發(fā)展中起到重要作用［3］。氧化應激被認為是許多疾病的一個重要組成部分，已經(jīng)被在許多種疾病的細胞模型中進行研究。視網(wǎng)膜因為其對于氧氣的大量消耗及不飽和脂肪酸的高構(gòu)成比和暴露于可見光中，使視網(wǎng)膜對于氧化應激極為敏感［4］。視網(wǎng)膜色素上皮細胞構(gòu)成了光感受器與脈絡膜之間的血-視網(wǎng)膜屏障的外層。視網(wǎng)膜色素上皮細胞清除光感受器副產(chǎn)物等生理功能，導致它們整個生命過程持續(xù)暴露于一定數(shù)量的活性氧(ROS)中，包括過氧化氫和超氧化物［5，6］。盡管有多種生理性防御機制存在，來保護視網(wǎng)膜-視網(wǎng)膜色素上皮免于氧化損傷，有證據(jù)顯示累積的氧化暴露破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞連接和屏障的完整性，誘導視網(wǎng)膜色素上皮細胞起泡［7，8］。這些改變使視網(wǎng)膜易于發(fā)生黃斑變性。

本研究采用MTT法檢測不同濃度H2O2處理對人RPE細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后細胞活力降低，細胞數(shù)量減少，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，H2O2的濃度越高，細胞存活率越低，細胞抑制率越高，當 H2O2濃度為200 μmol/L，抑制率在53.20%時，損傷相對適中，和對照組比較有顯著統(tǒng)計學意義，故后續(xù)試驗選擇200 μmol/LH2O2作為細胞氧化損傷的最佳濃度。同時采用CCK-8檢測人RPE細胞經(jīng)200 μmol/LH2O2處理 2、8、24 h 后細胞活力的變化，與對照組比較細胞的活力均出現(xiàn)顯著降低，而且與時間成依賴性，說明細胞氧化損傷模型構(gòu)建成功。

針對細胞氧化損傷相關(guān)的其他指標，如MDA、SOD等指標的檢測，有助于更準確地描述氧化損傷模型細胞的功能，特別是細胞抗氧化系統(tǒng)功能的變化，進一步確認模型的構(gòu)建是否合理;同時觀察這些指標在對照組和損傷組中的變化趨勢，也有助于推測和理解下一步研究中的目標藥物發(fā)揮保護(或損傷)作用的機制［9～12］。

SOD是體內(nèi)最重要的氧自由基清除劑，其基礎(chǔ)水平代表了細胞對抗氧自由基的能力，而損傷過程中SOD下降反映了細胞遭受氧化損傷攻擊的嚴重程度。本研究中人RPE細胞經(jīng)200 μmol/L H2O2處理2、8、24 h后，與對照組比較細胞抗氧化物酶SOD活性均出現(xiàn)顯著降低，間接反映了細胞的結(jié)構(gòu)和功能損傷程度。

細胞受到H2O2損傷后，細胞內(nèi)生成大量活性自由基，引發(fā)細胞膜上脂質(zhì)過氧化反應，生成終產(chǎn)物MDA;并且大量損耗細胞內(nèi)源性抗氧化劑如 GSH等，破壞細胞內(nèi)氧化與抗氧化平衡，使細胞處于氧化應激狀態(tài)［13～16］，MDA 作為脂質(zhì)過氧化的天然產(chǎn)物，可以一定程度上反映ROS造成損傷的程度，本研究發(fā)現(xiàn)人 RPE 細胞經(jīng) 200 μmol/L H2O2處理 2、8、24 h后，與對照組比較細胞MDA含量均有顯著升高，說明H2O2處理引起了細胞內(nèi)脂質(zhì)強烈的過氧化反應。

本研究采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)經(jīng) 200 μmol/L H2O2處理 2、8、24 h 后，與對照組比較細胞凋亡率有極顯著差異，說明200 μmol/LH2O2作用處理人RPE細胞后，誘導了明顯的細胞凋亡或壞死。

綜合上述，200 μmol/LH2O2作用處理人RPE細胞，不僅影響了細胞的活性、誘導了明顯的凋亡或壞死，而且伴隨著細胞內(nèi)ROS升高、脂質(zhì)過氧化升高、SOD耗竭等一系列變化，符合RPE細胞氧化應激過程中應有的反應，且這些指標的變化具有良好的穩(wěn)定性和可重復性，損傷組和對照組間變化的幅度也均達到了統(tǒng)計學的要求，有利于體外研究和篩選抗氧化藥物，是體外模擬RPE細胞氧化損傷的良好模型。

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Development of a model of oxidative damage of human retinal pigment epithelial cells induced by hydrogen peroxide

YANG Ying，QU Chao (Department of Ophthalmology，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，610072，China)

QU Chao

Objective To develop a model of oxidative damage of retinal pigment epithelial(RPE)cells．MethodsCultured human RPE cells were divided into normal group and experimental group．The experimental group was treated with 50，100，200，300 and 400 μmol/L H2O2while the control group was not treated with H2O2．The cell growth inhibition rate was detected with MTT assay，The incubator was cultured for 2，8，and 24 h and the cell inhibition rate was detected by using CCK-8．The changes in superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were measured with colorimetry method．Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis rate．ResultsCompared to the control group，the vitality of humna RPE cells and the activity of antioxidant enzyme SOD were significantly reduced after 2，8 and 24 hours of treatment(P ＜ 0.05)，but MDA content was significantly increased(P ＜ 0.01)．Apoptosis rate were significantly higher in the control group when compared to the experimental group(P ＜ 0.01)．ConclusionHuman RPE cells treated with 200 μmol/L H2O2is an appropriate model of oxidative damage of RPE cell in vitro．

R774.1

A

1672-6170(2017)04-0018-04

2016-12-12;

2017-04-24)

四川省科技廳應用基礎(chǔ)研究項目(編號:30504010256)

曲 超