葉 青,許云賀,張莉力,*(.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州000; .錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧錦州000)

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利用干酪乳桿菌YQ336制備酸漿豆腐凝固劑的發(fā)酵條件優(yōu)化

葉 青1,許云賀2,張莉力1,*
(1.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州121000; 2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧錦州121000)

以產酸量和菌體密度為指標,利用單因素實驗和響應面實驗,從發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、接種量、碳源及碳源添加量幾個方面,對從自然發(fā)酵酸漿中分離出的一株干酪乳桿菌YQ336進行發(fā)酵條件的優(yōu)化。最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度37 ℃、初始pH6.0,接種量3%,碳源為葡萄糖,添加量5%,此時乳酸產量為28.81 g/L,總酸產量為34.245 g/L。實驗結果表明干酪乳桿菌YQ336可以在此條件下發(fā)酵為純種酸漿豆腐凝固劑,并用于工業(yè)生產點制酸漿豆腐。

干酪乳桿菌,酸漿豆腐,豆腐凝固劑,高效液相色譜

酸漿豆腐在我國有上千年的加工歷史。酸漿是豆腐制作過程中產生的廢水——黃漿水經自然發(fā)酵變酸即為酸漿,酸漿是利用其所含的乳酸來制作豆腐,制成的豆腐更為醇香[1-3]。與石膏、鹽鹵以及內酯等外來物種相比,源自豆腐本身的酸漿更為天然、綠色和安全;同時,減少了豆腐廢水排放造成的環(huán)境污染[4]。但是,傳統的酸漿是自然發(fā)酵的產物,受環(huán)境因素的影響較大,很難控制酸漿的酸度,導致了生產的酸漿豆腐品質很不穩(wěn)定。另一方面,自然發(fā)酵過程中,除有益菌外,還有許多腐敗雜菌的存在,從而會導致所生產的酸漿豆腐保質期短[5]。如果將酸漿改為嚴格的純種發(fā)酵,將解決以上兩個問題。

黃漿水營養(yǎng)成分豐富,只需補充適量碳源即可滿足微生物生長需要[6]。呂博[7]在研究發(fā)酵黃漿水有機酸凝固劑制備時發(fā)現,酸漿中乳酸含量越多,豆腐的乳香味越濃,本文經過大量實驗后,決定以豆腐黃漿水添加適量碳源為培養(yǎng)基,通過單因素實驗和響應面法對從自然發(fā)酵酸漿中分離出的一株產酸能力強的乳酸菌[8],即干酪乳桿菌YQ336進行發(fā)酵條件的優(yōu)化,并利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測定其產乳酸量[9]。該干酪乳桿菌YQ336可接種于豆腐黃漿水中發(fā)酵成為豆腐凝固劑,本研究使用的黃漿水均是由該乳酸菌的發(fā)酵液作為豆腐凝固劑點制酸漿豆腐后過濾而來,黃漿水既可用做培養(yǎng)基,其發(fā)酵液又可作為豆腐凝固劑,如此重復利用,充分利用資源且保護環(huán)境。本研究采用食品級大豆,以天然的豆腐黃漿水為基礎,不引入化學試劑,只添加少量無害的碳源,優(yōu)化純種酸漿的發(fā)酵條件,使干酪乳桿菌YQ336的產酸能力達到最優(yōu),為酸漿豆腐的工業(yè)化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級大豆 購于錦州新瑪特超市;黃漿水 酸漿豆腐制作過程中的副產物,實驗室自制;干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)YQ336 本實驗室分離且已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No. 12796;黃漿水培養(yǎng)基 新鮮黃漿水加入2%葡萄糖;葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、氫氧化鈉、乙腈、磷酸、瓊脂 分析純,天津市科密歐化學試劑。

SW-CJ-1C型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司;M4-AL204型電子分析天平 蘭州中西儀器;DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;DHP-9052型 pH計 上海一恒科技有限公司;UV-1600型紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;LC-15C型高效液相色譜儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 干酪乳桿菌YQ336的活化 黃漿水培養(yǎng)基接種干酪乳桿菌YQ336培養(yǎng)進行活化,37 ℃恒溫培養(yǎng),測定其活菌數,以24 h內達到活菌數>106CFU/mL止[10-11]。

1.2.2 實驗室自制黃漿水及豆腐凝固劑的制作 首先在實驗室以醋酸為凝固劑點制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水加2%葡萄糖,調pH6.0,于115 ℃滅菌30 min后接種活化好的干酪乳桿菌YQ336,37 ℃恒溫發(fā)酵24 h,即為一代豆腐凝固劑。用一代豆腐凝固劑點制豆腐,剩余的黃漿水加2%葡萄糖,調pH6.0,于115 ℃滅菌30 min后接種3%一代豆腐凝固劑,37 ℃恒溫發(fā)酵24 h,即為二代豆腐凝固劑。用二代豆腐凝固劑點制豆腐,剩余的黃漿水加2%葡萄糖,調pH6.0,于115 ℃滅菌30 min后接種3%二代豆腐凝固劑,37 ℃恒溫發(fā)酵24 h,即為三代豆腐凝固劑(如此可以消除醋酸對后續(xù)實驗的影響)[1]。三代后的凝固劑即為本實驗所用的豆腐凝固劑,用三代后豆腐凝固劑點制豆腐剩余的黃漿水即為本實驗所用的黃漿水。

1.2.3 接種液的制備 在黃漿水中添加2%的葡萄糖,調整初始pH為6.0,115 ℃滅菌30 min,接種3%活化好的干酪乳桿菌YQ336,37 ℃培養(yǎng)24 h,即為接種液,備用。

1.2.4 單因素實驗 以產酸量、OD值為指標,主要考察碳源、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、種子液接種量、碳源添加量六個因素對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響。碳源:固定種子液接種量3%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h、初始pH6.0,固定添加量為2%,改變碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖;發(fā)酵時間:固定種子液接種量3%、葡萄糖添加量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、初始pH6.0,改變發(fā)酵時間為12、24、48、72、96、120、144 h;發(fā)酵溫度:固定種子液接種量3%、葡萄糖添加量2%、發(fā)酵時間24 h、初始pH6.0,改變發(fā)酵溫度為15、20、25、30、35、40、45 ℃;初始pH:固定種子液接種量3%、葡萄糖添加量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h,初始pH分別設置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0;種子液接種量:固定葡萄糖添加量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h、初始pH6.0,改變種子液接種量為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%;碳源添加量:固定種子液接種量3%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h、初始pH6.0,改變碳源添加量為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%。

1.2.5 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件 在單因素實驗的基礎上,以發(fā)酵溫度、初始pH、種子液接種量3個因素為自變量,以產酸量為響應值,利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設計法設計3因素3水平響應面實驗,對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵條件進行優(yōu)化[12-14]。實驗因素和水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels ofresponse surface methodology

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 產酸量的測定 按照國標GB/T 12456-2008。

1.2.6.2 pH 采用DHP-9052型酸度計測定。

1.2.6.3 OD值 采用紫外分光光度法,波長600 nm,將發(fā)酵液稀釋20倍后,以未接菌的培養(yǎng)基為空白,測菌體密度。

1.2.6.4 產乳酸量的測定 高效液相色譜法,色譜柱為WondaSil C18-WR(250 mm×4.6 mm,5 μL),色譜條件為:檢測波長210 nm,流動相(乙腈∶pH2.0磷酸=10∶90),柱溫為35 ℃,進樣量10 μL,流速0.8 mL/min。流動相配制好后分別過0.45 μm濾膜待用。乳酸標準品制備:經過預實驗后,將標準品稀釋到0.5、1、2、3、4 mg/mL五個梯度,4 ℃保存。樣品處理:將樣品于50 ℃超聲提取20 min,稀釋十倍后過0.22 μm濾膜待用[15]。

1.3 數據處理

數據折線圖和標準曲線采用 Excel 2007制作,數據統計采用SPSS 19.0進行ANOVA單因素方差分析及S-N-K多重檢驗(p<0.05),數值以均值±標準差表示。響應面實驗采用采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設計法分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同碳源對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響 由圖1可知,綜合五種碳源下干酪乳桿菌YQ336的產酸量和OD值,葡萄糖的產酸量和菌體密度最優(yōu),分別為(24.41±0.11)g/L和0.534±0.006,與其他碳源結果差異顯著(p<0. 05)。因此葡萄糖為最優(yōu)碳源,更適合提供黃漿水中缺乏的營養(yǎng)素。

圖1 不同碳源對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336注:同一測定指標,字母不同表示差異顯著 (p<0.05);圖1～圖6同。

2.1.2 發(fā)酵時間對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響 由圖2可以看出,隨發(fā)酵時間的延長,產酸量和菌體密度先升高后穩(wěn)定基本不變,48 h時最大產酸量為(23.24±0.14) g/L。菌體密度隨時間延長先升高后略有降低,可能是48 h前為菌體生長對數期菌體密度達到最高,48～72 h為穩(wěn)定期變化不顯著(p>0.05),96 h后進入衰亡期,細菌死亡解體,OD值與72 h，前呈差異顯著(p<0.05)。因此,出于節(jié)約時間考慮，發(fā)酵時間以48 h為宜。

圖2 發(fā)酵時間對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.3 發(fā)酵溫度對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響 由圖3可以看出,隨發(fā)酵溫度的升高,產酸量和菌體密度均先升高后降低,35 ℃與40 ℃的菌體密度無顯著差異(p>0.05),產酸量與其他各組相比呈顯著差異(p<0.05),40 ℃時產酸量最高為(21.72±0.12) g/L,稀釋20倍后測得的菌體密度最高為0.558±0.004。說明溫度過高抑制干酪乳桿菌的生長,因此發(fā)酵溫度以40 ℃為宜。

圖3 發(fā)酵溫度對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.4 初始pH對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響 由圖4可知,pH由5～7時,產酸量和菌體密度先上升后下降,可能偏酸性環(huán)境適宜該乳酸菌生長,綜合考慮pH為5.5時兩個指標的平均值最優(yōu),產酸量為(24.4±0.11)g/L,菌體密度為0.647±0.007。

圖4 初始pH對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial pH on fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.5 種子液接種量對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響 由圖5可以看出,3%接種量時,產酸量與OD值最優(yōu),且均與其他水平呈顯著差異(p<0.05),此時產酸量為(24.87±0.11) g/L,OD值為0.664±0.005。因此3%接種量更適合該菌種的發(fā)酵。

圖5 種子液接種量對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of inoculation amount of seed liquid on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.6 葡萄糖添加量對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響 根據圖6可知,隨著葡萄糖添加量的增多,產酸量和OD值均升高,最高時為產酸量(24.21±0.12) g/L,OD值0.557±0.006,此時葡萄糖的添加量為5%,產酸量與其余各組間呈顯著差異(p<0.05),因此選擇5%的添加量為宜。

圖6 葡萄糖添加量對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of glucose addition on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.2 響應面優(yōu)化發(fā)酵條件

2.2.1 響應面實驗結果 采用SPSS 19.0進行ANOVA單因素方差分析及S-N-K多重檢驗(p<0.05)對六組單因素水平進行篩選,最終確定以初始pH、發(fā)酵溫度、種子液接種量3個因素為主要考察因素,以產酸量為考察指標對干酪乳桿菌YQ336的發(fā)酵條件進行響應面實驗,實驗設計與結果見表2,方差分析見表3。

表3 響應面實驗方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

注:**:差異極顯著,p<0.01;*:差異顯著,p<0.05。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設計法對表2數據進行多遠二次回歸擬合,得到回歸模型方程為:Y=31.98+3.83A+0.67B+3.98C-0.073AB+1.27AC+0.14BC-1.48A2-0.058B2-4.36C2。

2.2.2 響應面分析 保持三個因素中的一個為最優(yōu),其他兩個因素與響應值關系用三維坐標圖表示,可直觀反映各因素對響應值的影響關系。等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應的強弱,圓形表示不顯著,而橢圓則表示顯著[16-17]。結果見圖7。

圖7 初始pH、接種量、發(fā)酵溫度的交互作用對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵條件影響的等高線和響應面圖Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction among initial pH,inoculum size and fermentation temperature on the fermentation conditions of Lactobacillus casei YQ336

比較各因素間兩兩相互作用的響應面曲線圖和等高線圖,可以看出AB、BC的等高線圖形均為扁圓形近似圓形且響應面圖形曲線趨勢均較平緩,而AC的等高線圖形為橢圓形且響應面圖形曲線趨勢陡峭,表明初始pH和接種量兩個自變量之間以及接種量和發(fā)酵溫度兩個自變量之間的交互效應較弱,初始pH和發(fā)酵溫度兩個自變量之間的交互效應較強。

2.2.3 最佳發(fā)酵條件 根據Design-Expert 8.0.6軟件求出的回歸模型極值點,結果表明得出最高指標時各個因素組合為:A=6.21,B=3.16,C=36.63,即初始pH為6.21,接種量為3.16%,發(fā)酵溫度為36.63 ℃,此時產酸量最高為35.1472 g/L。為方便生產應用調整初始pH為6,接種量為3%,發(fā)酵溫度為37 ℃。以調整后的發(fā)酵條件進行三次認證實驗,得到pH為3.37,產總酸量為34.245 g/L,是回歸預測理論值35.1472 g/L的97.43%,說明該方程與實際情況擬合良好,適用于對干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵條件進行回歸分析和參數優(yōu)化。

2.2.4 產乳酸量的測定結果 響應面優(yōu)化后,利用HPLC法測最優(yōu)發(fā)酵條件下干酪乳桿菌YQ336的產乳酸量,乳酸標樣的標準曲線見圖8。

圖8 乳酸標準樣品的標準曲線Fig.8 Standard curve of lactic acid standard sample

乳酸標樣出峰時間為2.769 min,根據乳酸標樣不同濃度的峰面積做出如圖8所示的標準曲線Y=2779X-82.596,R2=0.9996。表明這種色譜條件下測出的乳酸線性關系很好。根據樣品峰面積計算出干酪乳桿菌YQ336在響應面最優(yōu)條件下產乳酸量為28.81 g/L,是劉冬梅[18]等人測定干酪乳桿菌在泡菜液中發(fā)酵48 h后產乳酸量13.696 g/L的2.1倍。

3 結論

本研究綜合單因素實驗和響應面實驗產乳酸量的結果,得出最適干酪乳桿菌YQ336發(fā)酵的條件為:發(fā)酵溫度為37 ℃,初始pH為6,發(fā)酵時間為48 h,接種量為3%,葡萄糖添加量為5%,在此條件下發(fā)酵,可得到pH為3.37,產酸量為34.245 g/L,產乳酸量為28.81 g/L的酸漿。該乳酸菌分離篩選自自然發(fā)酵的酸漿中,產乳酸量能力強,純種發(fā)酵無有害菌摻入,作為豆腐凝固劑使用,延長了酸漿豆腐的保質期,可以代替自然發(fā)酵酸漿,作為一種新型的酸漿豆腐凝固劑進行工業(yè)生產和走入家庭。

[1]張影,劉志明,劉衛(wèi),等. 酸漿豆腐的工藝研究[J]. 農產品加工,2014,344(2):21-26.

[2]C G Viderola,P Mocchiutti,J A Reinheimer. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products[J]. J Dairy Sci,2002,85(3):721-729.

[3]王愛偉,孫冰潔.酸漿豆腐廢水中發(fā)酵假絲酵母的研究[J].中國釀造,2009(10):44-46.

[4]李燕. 酸漿中微生物的應用研究[D]. 濟南:山東輕工業(yè)學院,2003.

[5]喬支紅,閆佳,陳虹,等. 酸漿標準化生產工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(12):162-164.

[6]趙貴麗,羅愛平,廖婭凡,等.酸漿最適自然發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科學,2013,34(17):201-204.

[7]呂博. 發(fā)酵黃漿水有機酸凝固劑的制備及應用研究[D]. 哈爾濱:哈爾濱商業(yè)大學,2014.

[8]Wright B E,Longacre A,Reimers J. Models of metabolism in Rhizopus oryzae[J]. J Theor Biol,1996,182:453-457.

[9]Giusti F,Caprioli G,Ricciutelli M,et al. Determination of fourteen polyphenols in pulses by high performance liquid chromatography-diode array detection(HPLC-DAD)and correlation study with antioxidant activity and colour[J]. Food Chemistry,2017,221(4):689-697.

[10]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010食品微生物學檢驗 菌落總數測定[S].北京:中國標準出版社,2010.

[11]尹彥洋,羅愛平,李施,等.兩種乳桿菌協同發(fā)酵牛骨粉促鈣轉化的工藝研究[J].食品科學,2009(21):178-183.

[12]劉松,李祝,周禮紅,等. 響應面法優(yōu)化黑曲霉產纖維素酶的發(fā)酵條件[J]. 食品科學,2013(17):225-229.

[13]Chmiel T,Kupska M,Wardencki W. Application of response surface methodology to optimize solid-phase microextraction procedure for chromatographic determination of aroma-activemonoterpenes in berries[J]. Food Chemistry,2017,221(4):1041-1056.

[14]Raza A,Feng Li,Xiuquan Xu. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of antioxidant polysaccharides from the stem of Trapa quadrispinosa using response surface methodology[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2017,94(1):335-344.

[15]郭子好,方華,夏志生,等. 反相高效液相色譜法測定發(fā)酵豆粕中的乳酸含量[J]. 飼料工業(yè),2014,S1:121-123.

[16]張安寧,劉連成. 響應面法優(yōu)化香菇液體發(fā)酵條件[J]. 江蘇農業(yè)科學,2014(3):200-203.

[17]Torchio F,Giacosa S,Vilanova M,et al. Use of response surface methodology for the assessment of changes in the volatile composition of Moscato bianco(Vitis vinifera L.)grape berries during ripening[J]. Food Chemistry,2016,212(10):576-584.

[18]劉冬梅,吳暉,余以剛,等. 高效液相色譜法對泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分離和測定[J]. 現代食品科技,2007(8):74-76.

Optimization of fermentation conditions for preparation of
acid slurry bean curd coagulants byLactobacilluscaseiYQ336

YE Qing1,XU Yun-he2,ZHANG Li-li1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

Using single factor experiments and response surface experiments,with the acid yield and cell density as indicators,the optimization of fermentation condition ofLactobacilluscaseiYQ336 isolated from natural fermentative acid juice was carried out from the aspects of fermentation time,fermentation temperature,initial pH,inoculation amount,carbon source and carbon source addition.The optimum fermentation conditions were as follows:fermentation time 48 h,fermentation temperature 37 ℃,initial pH6.0,inoculation amount 3%,carbon source was glucose,adding 5%,under this condition,lactic acid production was 28.81 g/L,total acid yield was 34.245 g/L.The results showed thatLactobacilluscaseiYQ336 could be fermented into acid slurry bean curd coagulant under this condition and used in industrial production point to make acid slurry bean curd.

Lactobacilluscasei;acid slurry bean curd;tofu coagulant;high performance liquid chromatography(HPLC)

2017-02-07

葉青(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：18741650927@163.com。

*通訊作者:張莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：lilyzhang1977@163.com。

國家自然科學基金項目(31301499)；遼寧省自然科學基金項目(2014022052)；遼寧省自然科學基金項目(2014022046)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0106-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.021