李志　謝維威　楊祎

摘要 為了豐富農(nóng)科大學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，本文介紹了一種熱水法較短時(shí)間從魚(yú)鱗中提取明膠的技術(shù)，并用比色法對(duì)提取效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，該方法適合推廣為農(nóng)科大學(xué)有機(jī)化學(xué)或者綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞 魚(yú)鱗；明膠；熱水提取法；農(nóng)科大學(xué)；化學(xué)實(shí)驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào) G642；TS254.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）13-0285-02

Abstract In this research，we introduced an extraction technology of gelatin from fish scale by hot water method in a short time.The colorimetric method was used to evaluate the extraction efficiency.This research can enrich agricultural science university organic chemistry experiment contents.The results showed that the method is suitable to be applied to university organic chemistry or comprehensive chemistry experiment.

Key words fish scale；gelatin；hot water extracting method；agricultural science university；chemistry experiment

我國(guó)淡水魚(yú)產(chǎn)量豐富，居世界首位。每年淡水魚(yú)加工業(yè)的廢棄物總量達(dá)200萬(wàn)t以上，其中魚(yú)鱗約占15%。這些副產(chǎn)物的加工和利用程度很低，除少部分用于制造飼料魚(yú)粉外，其余都被廢棄，不僅造成了資源的極大浪費(fèi)，還嚴(yán)重污染了環(huán)境?；厥绽敏~(yú)鱗不僅能實(shí)現(xiàn)環(huán)境保護(hù)，還可以提高廣大研究者的研究興趣、激發(fā)學(xué)生的探索熱情。

現(xiàn)有的大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中，有一些實(shí)驗(yàn)涉及到天然產(chǎn)物的提取，但多是從植物體中提取有機(jī)物，如從茶葉中提取咖啡因、從植物中提取葉綠素、從果皮中提取果膠等，從動(dòng)物體中提取有機(jī)物的實(shí)驗(yàn)很少涉及。蛋白質(zhì)是一種重要的有機(jī)化合物，是《有機(jī)化學(xué)》和《生物化學(xué)》等教材中的一章重要內(nèi)容。本研究可以作為大學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)，尤其是農(nóng)科類(lèi)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)以及大學(xué)化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充內(nèi)容，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)可以使學(xué)生熟悉蛋白質(zhì)、明膠等物質(zhì)的區(qū)別，掌握魚(yú)鱗中明膠的提取方法和羥脯氨酸法分析明膠含量的方法，對(duì)學(xué)生掌握蛋白質(zhì)相關(guān)內(nèi)容、分析蛋白質(zhì)含量有十分重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

①了解魚(yú)鱗的組成成分。②了解膠原蛋白的結(jié)構(gòu)及檢測(cè)方法，了解膠原蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z的過(guò)程。③掌握萬(wàn)能粉碎機(jī)、分光光度儀等儀器的使用方法。④掌握比色法測(cè)定羥脯氨酸的方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 魚(yú)鱗成分介紹

魚(yú)鱗是魚(yú)體與外界接觸的邊緣組織，含有豐富的蛋白質(zhì)和各種礦物質(zhì)，起到保護(hù)魚(yú)體免遭損害的作用，是魚(yú)類(lèi)皮膚經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化而形成的衍生物。魚(yú)鱗主要由蛋白質(zhì)和羥基磷灰石組成，其中蛋白質(zhì)占50%～70%，主要為膠原蛋白和少量的角蛋白、球蛋白、粘蛋白等[1-3]。

完整結(jié)構(gòu)的膠原蛋白是一種纖維蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為3 000 kDa，最普遍的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)，由3條左手螺旋構(gòu)型的α多肽鏈組成。3條肽鏈相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)。它不溶于冷水和溫水，也不溶于酸、堿或鹽的稀溶液中。膠原蛋白局部水解后轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z[4-6]。

角蛋白是硬蛋白的一種，具有纖維結(jié)構(gòu)，在水、鹽類(lèi)溶液及稀的酸、堿溶液中完全不溶解。球蛋白、粘蛋白等雜蛋白含量少，易溶。易在魚(yú)鱗的反復(fù)清洗和前處理過(guò)程被除去。

灰分物質(zhì)主要由大量的羥基磷灰石[Ca（OH）2（PO4）6]和少量的無(wú)機(jī)鹽組成，這些鹽類(lèi)可用鹽酸處理，使之變成可溶性鹽除去。

2.2 明膠

明膠已經(jīng)失去了生物活性，是膠原在酸、堿、酶或高溫作用下的變性產(chǎn)物，主要有以下2個(gè)轉(zhuǎn)變過(guò)程。第一過(guò)程為熱變性，約40 ℃時(shí)發(fā)生。該過(guò)程使氫鍵或靜電性連接斷裂，相互纏繞的鏈彼此松開(kāi)進(jìn)入溶液，引起膠原螺旋解體，形成許多無(wú)規(guī)線(xiàn)團(tuán)。但是因?yàn)榻宦?lián)的穩(wěn)定因素在起作用，單靠此過(guò)程還不足以使成熟的膠原轉(zhuǎn)化為明膠。第二過(guò)程是共價(jià)交聯(lián)的水解。交聯(lián)鍵斷裂形成明膠碎片（分子），才能制得明膠。實(shí)際上，斷裂鍵是隨機(jī)過(guò)程，由所處條件決定，與pH值及溫度直接相關(guān)，故明膠不是均一的蛋白質(zhì)，而是一種混合物。因此，可以通過(guò)各種方式除去魚(yú)鱗中的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，最終提取得到產(chǎn)物明膠。

除雜反應(yīng)式（灰分）：Ca10（PO4）6（OH）2+20 HCl=10 CaCl2+6 H3PO4+2 H2O

2.3 明膠測(cè)定原理

羥脯氨酸是一種已有氨基酸，為膠原蛋白所特有，含量約為9%。將明膠水解之后測(cè)定其中的羥脯氨酸，再乘以相應(yīng)系數(shù)即得到明膠含量。

本實(shí)驗(yàn)中用比色法測(cè)定溶液中羥脯氨酸的含量。首先用氯胺T氧化羥脯氨酸生成含吡咯環(huán)的物質(zhì)，然后以高氯酸溶液除去多余的氯胺T；然后加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛溶液作為顯色劑，生成紅色化合物。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定560 nm處溶液吸光度，從而得到羥脯氨酸的含量。

3 試劑與儀器

試劑：鹽酸、氫氧化鈉、雙縮脲試劑（自制）、檸檬酸鈉、冰醋酸、檸檬酸、氯胺T、乙二醇獨(dú)甲醚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、高氯酸、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%）等。以上藥品除標(biāo)注外均為分析純。

儀器：燒杯、試管、玻璃棒、容量瓶、移液管、量筒、電子天平DT200、分析天平、組織粉碎機(jī)、萬(wàn)能粉碎機(jī)WF100、分光光度儀WFJ7200、比色皿、水泵、布氏漏斗、吸濾瓶、電磁攪拌器、水浴鍋等。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

4.1.1 原料前處理。對(duì)魚(yú)鱗原料進(jìn)行清洗并晾干。稱(chēng)取適量魚(yú)鱗，經(jīng)組織粉碎機(jī)簡(jiǎn)單除雜后，再用萬(wàn)能粉碎機(jī)處理，粉碎成棉絮狀[7-9]，稱(chēng)取7 g放入燒杯中。

4.1.2 除雜過(guò)程。加入0.4 mol/L鹽酸溶液150 mL[料液比（g∶mL）為1∶15]，電磁攪拌浸泡處理。2 h后抽濾，用去離子水洗滌濾餅至pH值為中性。將抽濾后固體放入燒杯中，再加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液150 mL[料液比（g∶mL）為1∶15]，電磁攪拌浸泡處理。15 min后抽濾，用去離子水洗滌濾餅至pH值為中性。

4.1.3 產(chǎn)物提取。向固體物質(zhì)中加入150 mL去離子水[料液比（g/mL）為1∶15]，60 ℃水浴加熱2.5 h，趁熱濾去固體物質(zhì)得明膠溶液，用容量瓶將液體定容至100 mL。

4.2 含量檢測(cè)

對(duì)明膠溶液進(jìn)行比色法檢測(cè)，測(cè)定其中明膠含量[10-13]。

（1）羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%）100 mg，加入0.01 mol/L鹽酸中溶解，然后定容至100 mL，置于冰箱中保存，備用。

（2）羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：吸取上述儲(chǔ)存液10 mL于容量瓶中，蒸餾水定容至100 mL（臨用前配），質(zhì)量濃度為100 mg/L。

（3）樣品水解液配制：取樣品5 mL放入A號(hào)燒杯，向其中加入6 mol/L氫氧化鈉溶液25 mL，作為實(shí)驗(yàn)組；取去離子水5 mL放入B號(hào)燒杯中，加6 mol/L氫氧化鈉溶液25 mL作為對(duì)照組。靜置20 min后用雙縮脲試劑定性檢測(cè)溶液。若A號(hào)燒杯無(wú)變色反應(yīng)，就從A號(hào)燒杯中吸取5mL溶液調(diào)pH值約為7，定容至1 00mL容量瓶中。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：分別吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL，用蒸餾水稀釋?zhuān)ㄈ葜?00 mL。分別取上述不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品水解液1mL于試管中，加入檸檬酸緩沖液1 mL和0.05 mol/L氯胺T溶液1 mL，室溫（25 ℃）氧化10 min。然后加入高氯酸1 mL，放置10 min。最后加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色試劑1 mL，在65 ℃水浴顯色10 min。冷卻后，以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定560 nm處吸光度。以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1，求出回歸方程。

5 結(jié)果與討論

5.1 產(chǎn)率計(jì)算公式

在測(cè)定過(guò)程中，相當(dāng)于將樣品稀釋了120倍，所以產(chǎn)率計(jì)算式為：

產(chǎn)率=■

其中，c為樣品中羥脯氨酸的濃度，n為稀釋倍數(shù)，V為產(chǎn)品原液總體積，11.1為轉(zhuǎn)換系數(shù)，m為魚(yú)鱗碎屑質(zhì)量。

5.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.066 6x+0.073 7。

5.3 測(cè)量結(jié)果及產(chǎn)率計(jì)算

A號(hào)樣品的吸光度為0.126。將數(shù)據(jù)代入羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到對(duì)應(yīng)濃度后再計(jì)算產(chǎn)率得1.49%。

6 注意事項(xiàng)

6.1 除雜過(guò)程

除雜時(shí)，應(yīng)用電磁攪拌機(jī)攪拌，以增加反應(yīng)速率。而且忌在除雜時(shí)加熱，否則目標(biāo)產(chǎn)物會(huì)迅速流失，大大降低產(chǎn)量。另外，酸堿液濃度不應(yīng)太高，處理時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則同樣會(huì)造成產(chǎn)物的大量溶解流失。

6.2 抽濾過(guò)程

本實(shí)驗(yàn)中，所有的固液分離步驟均采用抽濾法，快速省力。但一定要注意在抽濾完成后趁濕轉(zhuǎn)移固體，否則固體物質(zhì)粘滯在濾紙上不易轉(zhuǎn)移，會(huì)造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差。明膠溶液抽濾時(shí)，一定要趁熱抽濾，否則低溫下溶液將轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀，導(dǎo)致抽濾無(wú)法進(jìn)行。

6.3 羥脯氨酸含量測(cè)定

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，一定要估算待測(cè)溶液濃度，使待測(cè)溶液濃度處于標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度之中，否則將有較大誤差。

7 結(jié)語(yǔ)

該研究?jī)?nèi)容是將北京農(nóng)學(xué)院的大學(xué)生科研項(xiàng)目和基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程體系改革教學(xué)研究項(xiàng)目相融合的范例。項(xiàng)目自立項(xiàng)以來(lái)，在培養(yǎng)學(xué)生科研興趣、熟悉科研流程，以及如何將科研成果與基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)改革相結(jié)合方面做了許多有益的嘗試，本文介紹的大學(xué)生科研項(xiàng)目的成果可以作為農(nóng)科院校學(xué)生有機(jī)綜合實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，為豐富農(nóng)科院?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供參考。

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