馬銀鵬，于麗萍，2，馬鳴，韓冰，孔祥輝，2，*

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150020；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150028）

香菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

馬銀鵬1，于麗萍1，2，馬鳴3，韓冰3，孔祥輝1，2，*

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150020；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150028）

以香菇液體發(fā)酵胞外粗多糖得率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)研究液體發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基配方；測(cè)定胞外和胞內(nèi)粗多糖中蛋白質(zhì)、還原糖和多糖含量，并研究其體外對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除率。結(jié)果表明：香菇液體發(fā)酵最優(yōu)配方為葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。此配方下香菇胞外粗多糖中蛋白質(zhì)含量0.68%，還原糖含量6.17%，多糖含量25.6%；胞內(nèi)粗多糖中蛋白質(zhì)含量1.16%，還原糖含量7.01%，多糖含量32.3%；胞外粗多糖對(duì)羥自由基清除率為63.05%，對(duì)DPPH自由基清除率為62.05%。

香菇；液體培養(yǎng)；多糖；抗氧化活性

香菇，又名花菇、香蕈、冬菇，是世界第二大食用菌，稱為“山珍之王”[1]。香菇含有香菇多糖，具有分支的β-（1-3）-D-葡聚糖[2-3]，是一種宿主免疫增強(qiáng)劑[4-5]，具有抗腫瘤[6]、調(diào)節(jié)免疫功能[7]、抗病毒[8]、刺激干擾素生成、保肝解毒等多種活性[2-3，9]，目前已作為免疫增強(qiáng)劑用于臨床治療。香菇多糖具有很強(qiáng)抗衰老和抗氧化等活性[2，10-12]，研究香菇多糖抗氧化活性有助于降低細(xì)胞衰老速度，達(dá)到延年益壽的目的。因此，研究其抗氧化性對(duì)香菇多糖進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有極大潛在價(jià)值[13]。

目前，人們對(duì)香菇多糖的研究和開發(fā)利用主要集中在子實(shí)體多糖的研究上，而利用香菇菌絲體的研究報(bào)道較少[14]。液體深層發(fā)酵技術(shù)可生產(chǎn)食用菌菌絲體，同時(shí)獲得具有功效成分的發(fā)酵液[15]。用工業(yè)化液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)食用菌蛋白質(zhì)，比飼養(yǎng)家禽或家畜來(lái)獲取蛋白質(zhì)的時(shí)間短、效率高、成本低[16]。因此，食用菌深層發(fā)酵在食品工業(yè)方面有很大發(fā)展，有望成為21世紀(jì)人類所需主要蛋白質(zhì)的來(lái)源之一。液體發(fā)酵食用菌菌絲體還可用于制藥，對(duì)于在人工栽培條件下不易形成子實(shí)體或者其菌絲體與子實(shí)體含相類似有效成分的蕈菌，可利用發(fā)酵產(chǎn)物代替子實(shí)體[15]。目前，我國(guó)市場(chǎng)上供應(yīng)的食用真菌藥物，如蜜環(huán)片、靈芝菌片、寧心寶膠囊等均已采用液體發(fā)酵菌絲體生產(chǎn)[17]。食用菌的培植開始從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)跨入了工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)代[18]。

本研究以香菇為研究對(duì)象，通過(guò)正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)培養(yǎng)基配方，并提取香菇發(fā)酵體系的胞內(nèi)粗多糖和胞外粗多糖，測(cè)定粗多糖中蛋白質(zhì)、還原糖和多糖含量，并研究其對(duì)羥自由基和DPPH自由基清除率，為香菇多糖抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

香菇菌株2205：黑龍江省科學(xué)院微生物研究所；馬鈴薯、麥麩皮：市售。

1.1.2 試驗(yàn)試劑和主要儀器

硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖、苯酚、硫酸（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海星科生物技術(shù)有限公司；重蒸酚：北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；3，5-二硝基水楊酸：合肥博美生物科技有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；酵母膏：上海緣泰生物有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基（DPPH）：納川生物技術(shù)工作室。

臺(tái)式高速高性能冷凍離心機(jī)TGL20M-II：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；臥式精密搖床ZHWY-211B：河北德科機(jī)械科技公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV757CRT：上海儀電分析儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-53AA：北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香菇菌種活化

取200 g去皮馬鈴薯切片，煮沸30 min，濾液加酵母膏2 g、葡萄糖20 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g，定容至1 000 mL，121℃濕熱滅菌30 min。接種后于25℃，180 r/min培養(yǎng)10 d。

1.2.2 香菇最優(yōu)培養(yǎng)基配方研究

采用兩種碳源（葡萄糖和可溶性淀粉）、兩種氮源（酵母膏和麥麩皮），選擇L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每組3個(gè)重復(fù)。其中KH2PO4和MgSO4分別為0.1 g，維生素B12 mg。正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.3 香菇粗多糖提取

1.2.3.1 菌絲體處理

用八層紗布過(guò)濾香菇發(fā)酵菌液，沉淀用蒸餾水洗滌至無(wú)色后備用，濾液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 胞外粗多糖的制備

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，75 r/min，將過(guò)濾后的發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10 mL，用3倍體積的95%乙醇沉淀，4℃醇沉12 h，5 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用80%的乙醇潤(rùn)洗3次，于60℃烘干，獲得胞外多糖粗樣品。

1.2.3.3 胞內(nèi)粗多糖的制備

取過(guò)濾后的沉淀物，加30倍蒸餾水，用勻漿器打勻，95℃浸提1 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液1。對(duì)沉淀物重復(fù)上述操作，獲得上清液2。上清液1和上清液2混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10 mL，用3倍體積95%乙醇，4℃醇沉12 h后，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀用80%乙醇潤(rùn)洗3次，于60℃烘干，獲得胞內(nèi)多糖粗樣品。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量

稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，并用蒸餾水定容至1000 mL，備用。稱取牛血清蛋白，用蒸餾水配成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取牛血清蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL入試管中，以水補(bǔ)足至1.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-2505mL，于595nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水作對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸餾水溶解，5 000 r/min離心5 min取上清液，吸取上清液1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250 5 mL，測(cè)定同標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算可溶性蛋白含量。

1.2.5 3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量

準(zhǔn)確稱取烘干至恒重葡萄糖200 mg，配制2 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到5支試管中，以水補(bǔ)足至1.0 mL，分別加入DNS 2 mL，沸水浴中加熱2 min，取出置冰水中迅速冷卻，分別加入蒸餾水9 mL，搖勻，于540 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水作對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸餾水溶解，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液1 mL，加DNS 2 mL，處理同標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算多糖含量。

1.2.6 苯酚硫酸法測(cè)多糖含量

稱取100 mg烘干至恒重葡萄糖，加水溶解定容至100 mL，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL加入8支試管中，以水補(bǔ)足至2.0 mL，加入體積分?jǐn)?shù)為5%的重蒸酚溶液1 mL，5 mL濃硫酸，迅速振蕩均勻。100℃水浴15 min，迅速于冰水中冷卻，于490 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水作對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取粗多糖0.1 g，用100 mL蒸餾水溶解，5 000 r/min離心5 min取上清液，吸取上清液1 mL，加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，處理同標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算多糖含量。

1.2.7 羥自由基清除率的測(cè)定

胞外粗多糖樣液濃度為2 mg/mL。在A0試管中分別加入硫酸亞鐵1 mL、水楊酸1 mL、蒸餾水2 mL、H2O21 mL，不加樣品溶液。在AX中分別加入硫酸亞鐵1 mL、水楊酸1 mL、蒸餾水2 mL、H2O21 mL、樣品溶液2 mL。在AX0中分別加入硫酸亞鐵1 mL、水楊酸1 mL、蒸餾水2 mL、樣品溶液2 mL，不加H2O2。最后將每支試管加蒸餾水補(bǔ)足至7mL，再于510nm處測(cè)定吸光值。再將粗多糖樣液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，并分別配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC溶液，在相同操作下測(cè)定吸光值，對(duì)比多糖溶液和VC溶液和清除率的關(guān)系。

式中：A0為空白樣的吸光值，即不加樣品溶液；Ax為樣品組的吸光值，即加顯色劑H2O2和樣品溶液；Ax0為樣品本底吸光值，即不加顯色劑H2O2。

1.2.8 DPPH自由基清除率的測(cè)定

胞外粗多糖樣液濃度為2 mg/mL。取2 mL試樣于試管中，加入DPPH溶液2 mL，充分搖勻后，室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度。再將粗多糖樣液稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，并分別配置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC溶液，在相同操作下測(cè)定吸光值，對(duì)比多糖溶液和VC溶液和清除率的關(guān)系。

式中：A樣為DPPH和多糖均加入的體系；A對(duì)照為不加多糖溶液的體系；A空白為不加DPPH的體系。

2 結(jié)果與討論

2.1 香菇最優(yōu)培養(yǎng)基配方

葡萄糖和可溶性淀粉作為香菇菌絲體的碳源，酵母膏和麥麩皮作為香菇菌絲體的氮源，為香菇菌絲體生長(zhǎng)提供必需營(yíng)養(yǎng)成分。每種碳源和氮源添加量不同，胞外和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量存在差異。正交試驗(yàn)表見(jiàn)表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)表Table 2 The L9（34）table of orthogonal test

以為葡萄糖（A）、酵母膏（B）、可溶性淀粉（C）、麥麩皮（D）為考察因素，以胞外多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。由極差分析可知，液體發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)胞外粗多糖產(chǎn)量的影響主次為A＞D＞C＞B。由方差分析可知最優(yōu)方案為A3B3C2D3，即葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。以此配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此最優(yōu)配方下胞外多糖含量為5.917 4 g。

以胞內(nèi)多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。由極差分析可知，液體發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)胞內(nèi)粗多糖產(chǎn)量的影響主次為A＞C＞D＞B。由方差分析可知最優(yōu)方案為A3B1C1D3，即葡萄糖9 g、酵母膏0.3 g、可溶性淀粉3 g、麥麩皮24 g。以此配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此最優(yōu)配方下胞內(nèi)多糖含量為0.821 3 g。

綜合胞外多糖和胞內(nèi)多糖正交試驗(yàn)結(jié)果和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，選擇以胞外多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，香菇液體發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。

2.2 可溶性蛋白含量測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為Y= 0.059X+0.0001，R2=0.993。

圖1 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of protein concentration

測(cè)得香菇胞內(nèi)粗多糖中蛋白質(zhì)含量為1.16%，胞外粗多糖中蛋白質(zhì)含量為0.68%。

2.3 還原糖含量測(cè)定

葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為Y= 0.743X-0.020，R2=0.997。

圖2 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of glucose concentration

測(cè)得香菇胞內(nèi)粗多糖中還原糖含量為7.01%，胞外粗多糖中還原糖含量為6.17%。

2.4 多糖含量測(cè)定

葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，回歸方程為Y= 0.012X-0.010，R2=0.997。測(cè)得香菇胞內(nèi)粗多糖中多糖含量為32.3%，胞外粗多糖中多糖含量為25.6%。

2.5 羥自由基清除率測(cè)定

香菇胞外粗多糖對(duì)羥自由基清除率為（60.67± 1.09）%。不同多糖和VC濃度下羥自由基清除率結(jié)果如圖4所示。

羥自由基清除率均隨多糖濃度和VC濃度的增加而提高。當(dāng)濃度小于1.0 mg/mL時(shí)，香菇胞外多糖較VC對(duì)羥自由基清除率大，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，兩者對(duì)羥自由基清除率基本相當(dāng)。

圖3 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of glucose concentration

圖4 不同多糖與VC濃度對(duì)羥自由基的清除率Fig.4 The clearance rate of hydroxyl radical with different polysaccharide and VCconcentration

2.6 DPPH自由基清除率測(cè)定

香菇胞外粗多糖對(duì)DPPH自由基清除率為（60.57± 2.02）%。不同多糖濃度和不同VC濃度下DPPH自由基清除率結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同多糖與VC濃度對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 The clearance rate of DPPH with different polysaccharide and VCconcentration

隨著多糖濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增加，但是VC濃度對(duì)DPPH自由基的清除率基本保持在一個(gè)較高水平。隨著濃度增加，多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸接近。

3 結(jié)論

以胞外粗多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，正交試驗(yàn)獲得香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)配方：葡萄糖9 g、酵母膏0.9 g、可溶性淀粉6 g、麥麩皮24 g。此配方下香菇胞外粗多糖中可溶性蛋白含量為0.68%，還原糖含量為6.17%，多糖含量為25.6%；胞內(nèi)粗多糖中可溶性蛋白含量為1.16%，還原糖含量為7.01%，多糖含量為32.3%。

香菇液體發(fā)酵胞外粗多糖對(duì)羥自由基清除率為60.67%，較VC對(duì)羥自由基清除率好；對(duì)DPPH自由基清除率為60.57%，隨著濃度增加，多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸接近。

[1]王麗芹.香菇SD-08菌株多糖及其降解產(chǎn)物的提取、結(jié)構(gòu)及抗氧化抗衰老活性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2015

[2]Chihara G,Maeda Y Y,Hamuro J,et al.Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes[J].Nature,1969,222：687-688

[3]李金燦,陸輝,張相木,等.食用菌多糖特性與保健作用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)食用菌,2005,24(6)：7-11

[4]周蓮娣.香菇多糖對(duì)約氏瘧原蟲感染BALB/c小鼠紅內(nèi)期免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究[D].沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué),2008

[5]Lee S E,H wang H J.Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity[J].Life Sciences,2003,73(2)：167-179

[6]金道山,韓志濤,王士雯,等.香菇多糖抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].老年學(xué)雜志,1994,14(1)：40-41

[7]關(guān)健,陳學(xué)玲,薛淑靜,等.食用菌加工研究進(jìn)展與展望[J].河北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,12(1)：114-124

[8]Turlo J,Gutkowska B.Effect of selenium enrichment on antioxidant Activities and chemical composition of Lentinula edodes(Berk.）Pegl.my celial extracts[J].Food and Chemical Toxicology,2010,48 (4)：1085-1091

[9]趙宇,彭曉霞.多糖類化合物提取工藝研究[J].醫(yī)藥衛(wèi)生,2006,35 (12)：65-67

[10]Orak H H.Total antioxidant activities,phenolics,anthocyanins, polyphenoloxidase activities of selected red grape cultivars and their correlations[J].Scientia Horticulturae,2007,111(3)：235-241

[11]蔡錦源,朱熾雄,孫松,等.香菇多糖的微波預(yù)處理-超聲波提取工藝及其抗氧化活性研究 [J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版）, 2016,37(4)：84-90

[12]劉劍利,曹向宇,蘆秀麗,等.香菇菌絲體多糖的分離純化和抗氧化作用[J].食品科學(xué),2011,32(12)：19-23

[13]陳怡.天然多糖的研究概況 [J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化, 2010,2(6)：52-55

[14]鄒林武,趙謀明,游麗君.香菇多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(19)：177-182

[15]周昌艷,郭倩,白韻琴,等.灰樹花子實(shí)體與深層發(fā)酵菌絲體營(yíng)養(yǎng)組分分析[J].食用菌學(xué)報(bào),2001,8(1)：10-14

[16]席亞麗,治江,王曉琴,等.荷葉離褶傘子實(shí)體菌絲體和發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)成分比較分析[J].食品科學(xué),2010,31(6)：155-157

[17]Pan HH,Han YY,Huang JG,et al.Purifcation and identifcation of a polysaccharide from medicinal mushroom Amauroderma rude with immunomodulatory activity and inhibitory effect on tumor growth[J]. Oncotarget,2015,6(19)：17777-17791

[18]秦俊哲,陳明,陳合,等.食藥用真菌多糖的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)食用菌,2004,23(2)：6-9

The Optimal Formula of Liquid Medium on Lentinus edodes and Its Antioxidant Activities in vitro

MA Yin-peng1，YU Li-ping1，2，MA Ming3，HAN Bing3，KONG Xiang-hui1，2，*
（1.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，Heilongjiang，China；2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，Heilongjiang，China；3.Harbin University of Commerce，Harbin 150028，Heilongjiang，China）

The extracellular polysaccharide yields of Lentinus edodes liquid fermentation was took as main evaluation index to determine the optimal formula of liquid fermentation medium.The protein，reducing sugar and polysaccharide content of extracellular and intracellular polysaccharide was also studied.Then its clearance rate to hydroxyl radical（·OH）and DPPH·was studied in-vitro.The results showed that the optimal formula of L.edodes liquid fermentation contains glucose 9 g，yeast extract 0.9 g，soluble starch 6 g，wheat bran 24 g.We found that the protein content in extracellular polysaccharide of L.edodes accounts for 0.68%，reducing sugar content was 6.17%，polysaccharides content was 25.6%；protein content in intracellular polysaccharide was 1.16%，reducing sugar content was 7.01%，polysaccharides content was 32.3%.The clearance rate of extracellular polysaccharide to hydroxyl radical was 63.05%，to DPPH free radicals was 62.05%.

Lentinus edodes；liquid medium；polysaccharides；antioxidant activities

2016-12-09

黑龍江省科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)計(jì)劃（YC2015D002）

馬銀鵬（1987—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食用菌功效成分分離純化及活性研究。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.003