崔逸，蔣彩云，*，張翔，何海艷，陶曉琳，王瑞

（1.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)系，江蘇省食品安全工程技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京210007；2.南京視果黑枸杞開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇南京211135）

黑枸杞中抗氧化物質(zhì)的提取及花青素含量分析

崔逸1，蔣彩云1，*，張翔2，何海艷1，陶曉琳1，王瑞1

（1.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)系，江蘇省食品安全工程技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京210007；2.南京視果黑枸杞開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇南京211135）

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定黑枸杞中抗氧化物質(zhì)的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明影響提取效果的主次因素為：提取時(shí)間＜提取溫度＜提取劑＜料液比；最佳提取工藝條件為：超聲提取、料液比1：25（g/mL）、溫度50℃、溶劑60%乙醇、時(shí)間25 min。以維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)黑枸杞的總抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用pH示差法測(cè)定黑枸杞中花青素含量。

黑枸杞；花青素；抗氧化；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）；pH示差法

黑枸杞是枸杞屬科[1]，多年生灌木，具棘刺，漿果呈球形，皮薄，成熟后果皮呈紫黑色，紫色的果皮含有豐富的花青素，能有效清除體內(nèi)的自由基，由于其長(zhǎng)壽的作用而受到人們的追捧，制藥和保健價(jià)值明顯高于紅枸杞[2]?；ㄇ嗨兀且活?lèi)水溶性的類(lèi)黃酮化合物[3]，在自然界中普遍存在，超過(guò)300種。黑枸杞中所含的花青素由16種生物類(lèi)黃酮組成，不僅是當(dāng)前大多數(shù)植物花青素中功能最優(yōu)良的，而且比多數(shù)植物花青素有更優(yōu)良的生理活性?；ㄇ嗨貜母旧现v是一類(lèi)強(qiáng)有力的抗氧化劑，它能夠清除體內(nèi)某種自由基對(duì)人體的作用[4-6]。

以黑枸杞為原料，具有抗氧化功能的維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)參照，對(duì)黑枸杞中抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行提取，并對(duì)黑枸杞中的花青素含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黑枸杞：南京視果黑枸杞開(kāi)發(fā)有限公司；1，3-丁二醇、丙酮、醋酸鈉（分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、無(wú)水乙醇、維生素C（分析純）：國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 試驗(yàn)儀器

超聲波清洗器（KQ-500E）：昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平（FA2104N）：上海菁華科技儀器有限公司；萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（FW100）、電熱恒溫干燥箱（DGF 30/23-mA）：天津市泰斯特儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-6300）：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 配制DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液及清除率的計(jì)算

以無(wú)水乙醇作為溶劑，配制濃度為0.4 mmol/L的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于暗處備用。

提取液經(jīng)稀釋100倍后，按以下方法操作：

反應(yīng)溶液（A反應(yīng)液）：提取液2 mL和DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL混合；空樣溶液（A空樣液）：提取溶劑2 mL和 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL混合；空白溶液（A空白）：2 mL無(wú)水乙醇和2 mL提取液混合。將上述溶液置于避光處反應(yīng)30 min后，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。按（1）計(jì)算清除率。

1.3.2 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以純凈水作為溶劑，配制濃度為0.10 mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用逐級(jí)稀釋的方法，得到濃度梯度分別為0.008、0.010、0.012、0.014、0.016、0.018、0.020 mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液。

參照1.3.1中的操作方法，將提取液換成不同濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定相應(yīng)的吸光度值，得出對(duì)應(yīng)的DPPH·清除率，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 總抗氧化能力的測(cè)定

根據(jù)得到的最佳工藝條件處理黑枸杞粉，取提取液1 mL稀釋到100 mL容量瓶中，測(cè)出其DPPH·溶液的清除率，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每克黑枸杞樣品的維生素C當(dāng)量。

1.3.4 pH示差法測(cè)定黑枸杞中花青素含量

取黑枸杞提取液28.8 mL，稀釋至1 000 mL后，準(zhǔn)確量取20 mL（兩份），分別用pH=1、pH=4.5的緩沖溶液定容至100 mL，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定其吸光值，平行測(cè)定6次。根據(jù)T Fuleki的研究[7]結(jié)合比爾定律公式A=ebc（A：吸光度，e：摩爾吸收系數(shù)，c：吸光物質(zhì)的濃度，b：吸收層厚度），得到黑枸杞花青素含量的計(jì)算公式如下：

式中：X為花青素含量；ΔT為提取液在pH=1和pH=4.5緩沖溶液中的吸光度之差；F為稀釋度；V為稀釋的體積，mL；M1為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量值為449.2；M2為樣品的質(zhì)量，g；e為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)值為26 900[8]。

2 結(jié)果與分析

DPPH·是一種穩(wěn)定的脂性自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有明顯吸收峰。在有自由基清除劑存在時(shí)，會(huì)導(dǎo)致吸收峰減弱，從而使其褪色[9-10]。

通過(guò)可見(jiàn)分光光度計(jì)法，檢測(cè)DPPH·標(biāo)準(zhǔn)溶液與提取液反應(yīng)后的吸光度值的變化，測(cè)定樣品清除自由基的能力。建立提取液清除率的評(píng)價(jià)體系，以該標(biāo)準(zhǔn)體系為判斷依據(jù)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)黑枸杞中抗氧化活性成分提取效果的影響

稱(chēng)取1.0 g黑枸杞粉末于25 mL溶劑中，溶劑分別采用純水、無(wú)水乙醇、70%乙醇、1，3-丁二醇、丙酮，在室溫下靜置30 min，抽濾得到樣品的提取液。提取劑對(duì)提取效果影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取劑對(duì)提取效果影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction effect

由圖1可知，用70%乙醇提取時(shí)，得到的提取物抗氧化能力最強(qiáng)。

在考慮到節(jié)約的前提下，又分別采用50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、無(wú)水乙醇作為溶劑，在室溫下浸提30 min，抽濾得到樣品的提取液。乙醇濃度對(duì)提取效果影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effects of the ethanol concentration on extraction effect

由圖2可知，70%乙醇提取效果最佳。

2.1.2 提取方式對(duì)黑枸杞中抗氧化活性成分提取效果的影響

稱(chēng)取1.0 g黑枸杞粉末于25 mL70%乙醇中，提取溫度為40℃，提取方式分別為：超聲、振蕩、水浴、攪拌、靜置，提取時(shí)間為30 min，抽濾得到樣品的提取液。提取方式對(duì)提取效果影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取方式對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effects of different methods on extraction effect

由圖3可知，超聲波輔助方式（超聲頻率40 kHz）提取效果最好。這是由于超聲波輔助是利用超聲波的熱效應(yīng)、空化作用、機(jī)械作用使得胞外溶劑更容易進(jìn)入細(xì)胞，加速細(xì)胞壁的破碎，從而促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，提高提取效率。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑枸杞中抗氧化活性成分提取效果的影響

稱(chēng)取1.0 g黑枸杞粉末于25 mL70%乙醇中，提取溫度為40℃，超聲波輔助提取，提取時(shí)間分別為：15、25、35、45、55 min，抽濾得到樣品的提取液。提取時(shí)間對(duì)提取效果影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction effect

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效果呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在25 min時(shí)提取效果最好。這是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化物浸出率增加，但抗氧化物被氧化的程度也相應(yīng)增加。

2.1.4 提取溫度對(duì)黑枸杞中抗氧化活性成分提取效果的影響

稱(chēng)取1.0 g黑枸杞粉末于25 mL70%乙醇中，依次將提取溫度設(shè)定為20、30、40、50、60℃，提取時(shí)間為25 min。提取溫度對(duì)提取效果影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on extraction effect

由圖5可知，當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，提取效果隨著溫度的升高而相應(yīng)增加，但當(dāng)溫度超過(guò)50℃后，提取效果呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這是由于在低溫條件下，抗氧化物質(zhì)的溶解度小，不能被完全提取，隨著溫度的升高，提取效果逐漸增強(qiáng)，但由于抗氧化物質(zhì)本身容易被氧化，溫度繼續(xù)升高，會(huì)增加抗氧化物質(zhì)的氧化程度，從而影響提取效果，因此，最佳提取溫度為50℃。

2.1.5 料液比（g/mL）對(duì)黑枸杞中抗氧化活性成分提取效果的影響

稱(chēng)取1.0 g黑枸杞粉末于70%乙醇中，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為25 min，依次將液料比設(shè)定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）進(jìn)行提取。料液比對(duì)提取效果影響見(jiàn)圖6。

圖6 料液比與提取效果的關(guān)系圖Fig.6 Effects of the ratio for material and liquid on extraction effect

由如圖6可知，提取效果隨著乙醇用量的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)1∶25（g/mL）后，乙醇用量繼續(xù)增大，但提取效果增加不明顯。因此，料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，提取效果最佳。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取影響黑枸杞中抗氧化活性成分提取效果的主要因素水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。對(duì)L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析（見(jiàn)表2）和方差分析（見(jiàn)表3）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 The orthogonal design method

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9（34）orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2可知，四因素對(duì)提取效果的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間＜提取溫度＜提取劑＜料液比。由表3可知，所選取的4個(gè)因素對(duì)黑枸杞提取工藝的影響都較為明顯。最佳提取工藝條件是：料液比為1∶25（g/mL），提取劑為60%乙醇，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為25 min。

根據(jù)正交試驗(yàn)中的優(yōu)選方案，稱(chēng)取3份1.0 g黑枸杞樣品，分別加入25 mL的60%乙醇，50℃下超聲波輔助提取25 min得到提取液，測(cè)定清除率分別為：46.72%、43.01%、48.25%，即平均清除率為45.99%，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

2.3 黑枸杞總抗氧化能力的測(cè)定

以維生素C濃度為橫坐標(biāo)，以DPPH·清除率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖7所示。

圖7 維生素C溶液濃度與DPPH·清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of vitamin C solution with DPPH· scavenging activity

由圖7可知，維生素C濃度和DPPH·清除率之間符合線性關(guān)系，其線性方程為：y=32.911x-0.167 1。

采用最佳提取工藝條件對(duì)黑枸杞進(jìn)行提取，測(cè)定提取液的清除率，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每克黑枸杞樣品中抗氧化成分的維生素C當(dāng)量為109.73 mg。

2.4 黑枸杞中花青素含量的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定提取液中的花青素含量，按照公式（2）進(jìn)行計(jì)算，得到黑枸杞中的花青素含量為32.65 mg/g。

表4 黑枸杞中花青素含量的測(cè)定Table 4 The determination of the content of anthocyanin in black wolfberry

3 結(jié)論

通過(guò)超聲波輔助提取法對(duì)黑枸杞中抗氧化成分進(jìn)行提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分別檢查了不同的因素如提取劑濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度等對(duì)黑枸杞中抗氧化成分提取效果的影響，每個(gè)因素對(duì)抗氧化率的影響由小到大的順序?yàn)椋禾崛r(shí)間＜提取溫度＜提取劑＜料液比。確定黑枸杞抗氧化成分的最佳提取工藝條件為：提取溶劑60%乙醇，料液比1∶25（g/mL），提取時(shí)間25 min，提取溫度50℃。根據(jù)維生素C與DPPH·清除率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出每克黑枸杞中總抗氧化性的維生素C當(dāng)量為109.73mg。此外，采用pH示差法測(cè)定出黑枸杞中花青素含量為32.65 mg/g。

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Extraction and Content Analysis of Anthocyanin from Lycium Ruthenicum Murr

CUI Yi1，JIANG Cai-yun1，*，ZHANG Xiang2，HE Hai-yan1，TAO Xiao-lin1，WANG Rui1
（1.Department of Engineering and Technology，Jiangsu Vocational Institute of Commerce，Jiangsu Engineering and Research Center of Food Safety，Nanjing 210007，Jiangsu，China；2.Aishiguo Development Company，Nanjing 211135，Jiangsu，China）

The optimum extract conditions of the main antioxidant in black wolfberry were studied through sin glefactortestandorthogonaltest.Theresultsshowedthattheprimaryandsecondaryfactorsofextractioneffectwere as follows：extraction time＜extraction temperature＜concentration of solvent＜the ratio for material and liquid.The best extract conditions with ultrasonic extraction were identified that the ratio of solvent to black wolfberry，temperature，extract solvent，and time were 1：25（g/mL），50℃，60%ethanol and 25 min respectively.The antioxidant activity in black wolfberry was evaluated using vitamin C as the standard substance.In addition，the content of anthocyanin in black wolfberry was determined by pH differential method.

blackwolfberry；anthocyanin；antioxidant；1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）；pHdifferential method

2016-11-11

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161479）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（16KJB150043）；江蘇省青藍(lán)工程；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃（201612407015Y）；江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院重大課題（JSJM15005）

崔逸（1989—），男（漢），助教，碩士研究生；研究方向：納米復(fù)合材料在食品及環(huán)境分析方面的應(yīng)用研究。

*通信作者：蔣彩云，女，副教授，博士，研究方向：納米復(fù)合材料在食品及環(huán)境分析方面的應(yīng)用研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.007