郭雷，郭家才，鄭洪偉

（1.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，淮海工學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港222004）

花果山云霧茶中多酚和多糖的超聲同步提取工藝

郭雷1，2，郭家才1，鄭洪偉1

（1.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，淮海工學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港222004）

研究花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的超聲輔助同步提取工藝并評價提取物的抗氧化活性。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面分析法優(yōu)化的提取工藝為：超聲功率500 W，提取溫度80℃，提取時間37 min，液料比62∶1（mL/g）。在優(yōu)化的條件下，茶多酚和茶多糖的得率分別為（137.08±3.37）mg/g和（57.71±1.94）mg/g。固態(tài)提取物的得率為（2.51±0.27）%，其中茶多酚和茶多糖的含量分別為（548.31±13.48）mg/g和（227.28±6.44）mg/g。通過測定提取物的還原力、抗氧化力和對DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力評價其抗氧化活性，結(jié)果顯示提取物具有較強的還原力和總抗氧化力及清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的活性。

花果山云霧茶；茶多酚；茶多糖；響應(yīng)面分析法；抗氧化活性

antioxidant activity

茶是植物茶樹（Camellia sinensis）的葉子，是全球消費量僅次于水的飲料。依據(jù)其發(fā)酵程度的不同，可將茶分為綠茶（未發(fā)酵），烏龍茶（部分發(fā)酵）和黑茶（發(fā)酵）[1-2]。其中，綠茶是在中國和日本最流行的種類[3]。中國綠茶來源于600多個茶樹品種，具有豐富的種類，如龍井，碧螺春，毛峰，毛尖，雨花茶，云霧茶等。

綠茶含有豐富的活性成分如茶多酚（tea polyphenols，TPP），茶多糖（tea polysaccharides，TPS）和茶氨酸（theanine）等。茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，其中兒茶素是茶葉中含量最多的多酚類物質(zhì)，被認為是綠茶中主要的活性成分之一[4]。體外和動物實驗研究表明茶多酚具有多種生物活性，如抗氧化[5]，抗炎[6]，抗腫瘤[7]，抗菌[8]，抗病毒[9]，抗輻射[10]，提高免疫功能[11]，降血脂[12]，保護神經(jīng)及其他藥理活性[13-14]。茶多糖是綠茶中另一類主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明茶多糖具有廣泛的生理活性，如降血糖[15]，降血脂[16]，抗氧化[17]，抗凝集[18]，提高免疫力和保護皮膚等[19-21]?；诖耍瓒喾雍筒瓒嗵潜徽J為是有前途的天然藥物。

花果山云霧茶歷史悠久，是我國名貴綠茶之一，因其生長在崇山峻嶺之上，云霧繚繞之中，故稱之為“云霧茶”。花果山屬于云臺山脈，而云臺山自古就被稱為“茶山”。迄今為止，有關(guān)花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的提取和生物活性的研究未見報道。本研究應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲輔助同步提取花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的工藝，并評價了提取物的抗氧化活性，以期為花果山云霧茶的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花果山云霧茶：購自江蘇省連云港市當(dāng)?shù)夭枞~經(jīng)銷部；總抗氧化力測定試劑盒：南京建成生物技術(shù)研究所；福林酚試劑：上海荔達生物科技有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）、沒食子酸：美國Sigma公司；其它化學(xué)試劑均為分析級。

SK8210LHC型超聲清洗儀（40 kHz）：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QJ32W1000A型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；BS 124S型電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Synergy HT型多功能酶標儀：美國BioTek儀器有限公司；DDL-5M型離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取過程

茶葉粉碎后過40目篩，將茶葉粉與一定比例的蒸餾水加入100 mL具塞三角瓶中，置于超聲清洗儀中進行超聲輔助提取（將三角瓶固定于提取儀中央，加熱水位能超過三角瓶水位線）。提取液于5 000 r/min離心10 min，抽濾，濾液用于測定茶多酚和茶多糖的含量。

1.2.2 超聲輔助提取工藝優(yōu)化

Box-Behnken（BB）試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法用于優(yōu)化超聲輔助同步提取花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的工藝，Design Expert 7.0.0軟件用于分析數(shù)據(jù)和建立模型。提取溫度（X1），提取時間（X2）和液料比（X3）用于三因素三水平共17個試驗的BB試驗設(shè)計，茶多酚和茶多糖的得率作為響應(yīng)值。下列方程式用來解釋所構(gòu)建的模型：

其中：Y代表響應(yīng)變量；Xi和Xj是獨立變量；β0、βi、βii和βij分別代表截距、線性、二次和交互回歸系數(shù)。

1.2.3 多酚含量測定

茶多酚含量測定采用福林酚法，沒食子酸為標準對照[22]。將1.0 mL待測液加入裝有1.0 mL福林酚試劑（0.2mol/L）的試管內(nèi)，振搖5min，然后加入2.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，振搖，25℃下反應(yīng)1 h后，吸取上清液200 μL于96孔板內(nèi)，754 nm處測定吸光度。茶多酚含量以沒食子酸當(dāng)量表示（mg/g）。

1.2.4 多糖含量測定

茶多糖含量測定采用硫酸苯酚法，葡萄糖為標準對照[23]。將1.0 mL待測液與1.0 mL 5%苯酚相混勻，迅速加5.0 mL濃硫酸，室溫放置30 min，吸取150 μL于96孔板內(nèi)，于490 nm處測定吸收度。茶多糖含量以葡萄糖當(dāng)量表示（mg/g）。

1.2.5 還原力測定

提取物的還原力測定參考文獻[24]進行。將1.0 mL待測液加入10 mL EP離心管中，分別加入1.0 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）及1.0 mL鐵氰化鉀水溶液（1%），50℃水浴20 min后取出快速冷卻，加入1.0 mL三氯乙酸水溶液（10%），搖勻，5 000 r/min離心10 min。取1.0 mL上清液，依次加入1.0 mL蒸餾水，0.5 mL三氯化鐵水溶液（0.1%），充分混勻，放置10 min后，吸取200 μL于96孔板內(nèi)，測定其在700 nm處的吸光度值。吸光度越大，說明還原能力越強。

1.2.6 總抗氧化力測定

總抗氧化力測定采用試劑盒進行，一個單位的總抗氧化力定義為37℃時，每分鐘每毫升待測樣品液吸光度增加0.01。按標準操作規(guī)程加入相應(yīng)試劑，混勻，放置10 min，取反應(yīng)液200 μL加入96孔酶標板內(nèi)，在520 nm處測定吸光度?？偪寡趸Ω鶕?jù)下面的公式計算得出：Y=（As-Ac）×Vt×Vs×C/（0.01×30）。

式中：As和Ac分別表示樣品和對照的吸光度；Vt和Vs分別表示反應(yīng)液和樣品液的體積，mL；C表示樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.7 DPPH自由基清除活性測定

DPPH自由基清除活性測定參考文獻[25]進行。將100 μL待測液加入96孔板中，再加入100 μL的0.2 mmol/L DPPH溶液，搖勻。20 min后在517 nm測定其吸光度Ai，同時測定100 μL蒸餾水與2×10-4mol/L DPPH溶液的吸光度Ac，以及待測液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj。根據(jù)公式計算清除率：Y=（Ac-Ai+Aj）×100/Ac。

1.2.8 羥自由基清除活性測定

羥自由基活性測定參考文獻[26]進行。將50 μL待測液，50 μL 9 mmol/L硫酸亞鐵與50 μL 8.8 mmol/L H2O2于96孔酶標板充分混合后，分別加入50 μL 10 mmol/L水楊酸的乙醇溶液，搖勻，靜置20 min，在508 nm處測定吸光度（Ai）。用蒸餾水代替樣品液，測定得Ac。用蒸餾水代替H2O2溶液，測定得Aj。根據(jù)以下公式計算樣品對羥自由基的清除活性：Y=（Ac-Ai+Aj）× 100/Ac。

1.2.9 超氧陰離子自由基清除活性測定

采用鄰苯三酚自氧化方法測定提取物清除超氧陰離子自由基的活性[24]。取50 μL超純水和100 μL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.3，內(nèi)含2 mmol/L EDTA）加入96孔酶標板，充分混合后，于25℃保溫 20 min后加入預(yù)熱的50 μL 60 mmol/L鄰苯三酚（以10 mmol/L HCl溶液配制），迅速搖勻，于319 nm波長處每隔50 s測定吸光度，測定啟動后5 min內(nèi)鄰苯三酚自氧化的速率，記作ΔAc。以50 μL樣品液代替超純水，測定啟動后5 min內(nèi)樣品抑制鄰苯三酚自氧化的速率ΔAs。根據(jù)如下公式計算清除率：Y=（ΔAc-ΔAs）×100/ΔAc。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝

單因素試驗中，分別考察了超聲功率（200 W～500 W）、提取溫度（40℃～80℃）、提取時間（5 min～40 min）和液料比[20∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）]對茶多酚和茶多糖得率的影響?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，固定超聲功率500 W（100%），提取溫度（X1），提取時間（X2）和液料比（X3）用于三因素三水平共17個試驗的Box-Behnken（BB）試驗設(shè)計來優(yōu)化超聲輔助同步提取花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的工藝，茶多酚（Y1）和茶多糖（Y2）的得率作為響應(yīng)值（見表1）。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 1 Coded（actual）levels of the operational parameters and observed values of Box-Behnken design

通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，下列二階多項式方程可以解釋測試變量與響應(yīng)變量之間的關(guān)系：

表2顯示了BB試驗設(shè)計數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果。從表2可以看出，模型的P值分別小于0.000 1（茶多酚）和等于0.0005（茶多糖），表明構(gòu)建的2個模型均具有顯著性。而2個模型的失擬項值均無顯著性（P＞0.05），說明所構(gòu)建的2個模型能夠用于變量優(yōu)化的預(yù)測。2個模型的確定系數(shù)（R2）分別為0.973 9和0.959 2，顯示模型可以充分呈現(xiàn)獨立變量與相應(yīng)變量之間的實際關(guān)系[25]。

模型的響應(yīng)面圖可以很好的考察變量對茶多酚和茶多糖得率的影響[27]。提取溫度、提取時間、液料比和它們的相互作用對茶多酚和茶多糖得率的影響如圖1所示。從表2和圖1可以看出，提取溫度對茶多酚和茶多糖得率具有顯著的正向線性效應(yīng)（P＜0.000 1），隨著提取溫度的提高，茶多酚和茶多糖得率也隨之增加。提取時間是另一個影響提取效率的重要因素。當(dāng)

提取時間從20 min增加到37 min，茶多酚和茶多糖得率最高，隨后茶多酚和茶多糖得率不再增加。此外，液料比對茶多酚的得率也有顯著的影響（P=0.027 2），隨著液料比從50∶1（mL/g）增加到62∶1（mL/g），茶多酚的得率達到最高值。液料比對茶多糖的得率影響不顯著（P=0.077 7）。

表2 響應(yīng)面分析試驗方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for the quadratic response surface model

圖1 提取溫度與時間（a），溫度與液料比（b），提取時間與液料比（c）交互作用影響茶多酚和茶多糖的響應(yīng)曲面Fig.1 Response surface plots for the effects of temperature and time（a），temperature and liquid to material ratio（b），time and liquid to material ratio（c）on the yield of TPP and TPS missing value of in each plot kept at the center point

通過對方程（1）和（2）進行回歸分析，模型預(yù)測的最佳提取工藝為：X1=80℃，X2=37min，X3=62∶1（mL/g），即超聲功率500 W，提取溫度80°C，提取時間37 min，液料比62∶1（mL/g），預(yù)測的茶多酚和茶多糖得率分別為137.81 mg/g和58.58 mg/g。在最佳提取條件下進行驗證試驗，茶多酚和茶多糖的實際得率分別為（137.08± 3.37）mg/g和（57.71±1.94）mg/g，與預(yù)測值沒有顯著差異，表明響應(yīng)面分析法應(yīng)用于優(yōu)化超聲輔助同步提取花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的工藝是可行的。

為評價超聲輔助提取物的抗氧化活性，對利用上述優(yōu)化工藝條件下獲得的提取物進行減壓濃縮蒸發(fā)和冷凍干燥，獲得固態(tài)的超聲輔助提取物（UAE），其得率為（2.51±0.27）%，其中茶多酚和茶多糖的含量分別為（548.31±13.48）mg/g和（227.28±6.44）mg/g UAE。進一步評價了固態(tài)的超聲輔助提取物的抗氧化活性。

2.2 提取物的抗氧化活性

2.2.1 還原力和總抗氧化力

評價特定物質(zhì)的抗氧化活性需要多個評價體系的試驗結(jié)果，本研究通過還原力，總抗氧化力，對DPPH、羥基和超氧陰離子自由基的清除試驗評價了提取物（UAE）的抗氧化活性。研究表明，物質(zhì)的抗氧化能力與其還原力密切相關(guān)。在還原力測定試驗中，抗氧化劑能夠還原Fe3+成Fe2+，進而生成在700 nm波長處有最大吸收的普魯士藍復(fù)合物，吸光度越大，物質(zhì)的還原力越強[28]?？偪寡趸y試試驗中，F(xiàn)e2+能與菲啉類物質(zhì)形成在520 nm波長處有最大吸收的絡(luò)合物，吸光度越大說明物質(zhì)的總抗氧化能力越強。圖2顯示了花果山云霧茶提取物的還原力和總抗氧化力測試結(jié)果。從圖2可以看出，隨著提取物濃度的提高，其還原力和總抗氧化力也隨之增加，但低于陽性對照維生素C。

2.2.2 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除試驗被廣泛應(yīng)用于抗氧化劑清除自由基活性的評價中[27]。本試驗中，抗氧化劑清除DPPH自由基的能力取決于其作為氫供體的能力[29]，花果山云霧茶提取物清除DPPH自由基的活性見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)濃度從0.031 25 mg/mL提高到0.5 mg/mL，提取物和維生素C對DPPH自由基的清除率分別從（69.54±2.12）%和（78.30±1.67）%增加到（78.30±1.67）%和（89.67±1.31）%，結(jié)果顯示提取物具有顯著的清除DPPH自由基的能力。

圖2 花果山云霧茶提取物的還原力和總抗氧化力Fig.2 Reducing power and total antioxidant capability of UAE

圖3 花果山云霧茶提取物清除DPPH自由基的活性Fig.3 The DPPH free radical scavenging activity of UAE

2.2.3 羥自由基清除活性

羥自由基是生物體內(nèi)最容易產(chǎn)生和最活躍的反應(yīng)基團，能顯著損傷幾乎所有的生物大分子如蛋白質(zhì)、糖類、脂類及核酸，從而導(dǎo)致機體的衰老和許多疾病的發(fā)生[30]。抗氧化劑能夠通過螯合金屬離子Fe2+和Cu2+來抑制羥自由基的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其清除活性。羥自由基清除試驗中，羥自由基能夠通過Fe2+和H2O2反應(yīng)而產(chǎn)生，抗氧化劑則通過螯合Fe2+降低了羥自由基的產(chǎn)生[25]，花果山云霧茶提取物清除羥自由基的活性見圖4。如圖4所示，當(dāng)提取物濃度從0.062 5 mg/mL增加到1.0 mg/mL，其清除羥自由基的活性從（10.96± 0.44）%提高到（56.21±0.75）%，顯示提取物具有一定的羥自由基清除活性，但低于同濃度下維生素C的活性。

2.2.4 超氧陰離子自由基清除活性

圖4 花果山云霧茶提取物清除羥自由基的活性Fig.4 The hydroxyl free radical scavenging activity of UAE

超氧陰離子自由基是氧分子在氧化過程中呈單價還原而產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，是氧自由基連鎖反應(yīng)的啟動者，誘導(dǎo)H2O2和羥自由基的產(chǎn)生，從而引發(fā)體內(nèi)生物膜、激素及脂質(zhì)過氧化，加速機體衰老，并可誘發(fā)疾病的發(fā)生[31]?；ü皆旗F茶提取物清除超氧陰離子自由基的活性見圖5。如圖5所示，當(dāng)濃度從0.062 5 mg/mL增加到1.0 mg/mL，提取物和維生素C對超氧陰離子自由基的清除率分別從（14.45±1.21）%和（11.27±1.28）%增加到（57.07±3.23）%和（92.39± 2.31）%，結(jié)果顯示提取物具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力。

圖5 花果山云霧茶提取物清除超氧陰離子自由基的活性Fig.5 The superoxide free radical scavenging activity of UAE

3 結(jié)論

Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面分析法應(yīng)用于花果山云霧茶中茶多酚和茶多糖的超聲輔助同步提取工藝的研究是可行的，最佳的提取條件為：超聲功率500 W，提取溫度80℃，提取時間37 min，液料比62∶1（mL/g）。在優(yōu)化的條件下，茶多酚和茶多糖的得率分別為（137.08±3.37）mg/g和（57.71±1.94）mg/g。進一步評價了提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明提取物具有較強的還原力和總抗氧化力及清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的活性。本研究所獲得的關(guān)于花果山云霧茶的研究結(jié)果為該資源的深入開發(fā)與應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Ultrasonic-assisted Synchronous Extraction Process of Tea Polyphenols and Polysaccharides from Huaguoshan Yunwu Tea

GUO Lei1，2，GUO Jia-cai1，ZHENG Hong-wei1
（1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，School of Marine Life and Fisheries，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；2.Jiangsu Marine Resources Development Research Institute，Lianyungang 222004，Jiangsu，China）

The ultrasonic-assisted synchronous extraction conditions of tea polyphenols（TPP）and tea polysaccharides（TPS）from Huaguoshan Yunwu tea and antioxidant activities of the extracts were investigated.On the basis of single factor experiments，Box-Behnken design and response surface methodology were applied to optimize the extraction conditions.The optimal extraction conditions were as follows：ultrasonic power 500 W，extraction temperature 80℃，extraction time 37 min，liquid to material ratio 62∶1（mL/g）.According to the optimal process conditions，the yield of TPP and TPS were（137.08±3.37）mg/g and（57.71±1.94）mg/g dry basis. The yield of solid ultrasonic-assisted extracts（UAE）was（2.51±0.27）%，the contents of TPP and TPS were（548.31±13.48）mg/g and（227.28±6.44）mg/g UAE respectively.The antioxidative activities of UAE were estimated by measuring reducing power and total antioxidant capacity，the scavenging activities on DPPH free radical，hydroxyl free radical and superoxide anion free radical.The results indicated that UAE had the strong reducing power and total antioxidant capability，as well as the high eliminating activities on DPPH free radical，hydroxyl free radical and superoxide anion free radical.

Huaguoshan Yunwu tea；tea polyphenols；tea polysaccharides；response surface methodology；

2016-11-18

江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK20151283）；江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室基金項目（2014HS006）；連云港市521工程科研項目

郭雷（1977—），男（漢），副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：生物資源開發(fā)與利用。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.008