胡慶蘋(píng),裴棟,姜紅梅,祝瀟,魏鑒騰,王寧麗,邸多隆,*
(1.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心,山東青島266100;2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730000;3.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)
院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所,甘肅蘭州730000;4.蓬萊市疾病預(yù)防控制中心,山東煙臺(tái)265600)
響應(yīng)面法優(yōu)化海參多肽脫色工藝
胡慶蘋(píng)1,2,3,裴棟1,2,姜紅梅4,祝瀟1,2,魏鑒騰1,2,王寧麗1,2,邸多隆1,2,*
(1.青島市資源化學(xué)與新材料研究中心,山東青島266100;2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730000;3.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)
院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所,甘肅蘭州730000;4.蓬萊市疾病預(yù)防控制中心,山東煙臺(tái)265600)
為除去海參多肽中有色物質(zhì)以利于生物活性肽的分離純化,經(jīng)酶解法制備海參多肽酶解液,以脫色率和多肽回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察不同脫色劑對(duì)海參多肽酶解液的脫色效果,從中篩選出XX型粉末活性炭。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)脫色條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳脫色條件為:活性炭用量0.9 g/100 mL,時(shí)間32 min,溫度50℃,pH2.2,在此條件下,海參多肽液的脫色率達(dá)到(85.39±2.25)%,多肽回收率達(dá)到(88.57±1.86)%,與理論值無(wú)顯著差異。
海參多肽;活性炭;脫色;響應(yīng)面法
海參(Sea cucumber)是棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)海參綱(Holothurioidea)楯手目(Aspidochirota)的無(wú)脊椎動(dòng)物[1],因其較高的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值而被列為“八珍”之一[2]?,F(xiàn)代研究表明,海參中主要的功效成分是海參多肽、海參多糖和海參皂苷等[3]。海參多肽是由新鮮海參經(jīng)蛋白酶解后得到的具有功能特性的生物活性物質(zhì)[4],因其溶解性及穩(wěn)定性好,易吸收,且具有抗氧化[5-7]、降血壓[8]、降血脂[9]、提高免疫力[10]、緩解疲勞[11-12]等功能,已成為海參深度開(kāi)發(fā)的重要方向。
海參體壁多為棕色或深褐色,存在大量色素,使其蛋白酶解液,嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì),有礙于產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā)。目前常于多肽溶液脫色的脫色劑有:粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土、大孔吸附樹(shù)脂、復(fù)合吸附劑、弱堿性陰離子樹(shù)脂、強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂、弱酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂等[13]。
本文采用不同型號(hào)和類(lèi)型的脫色劑對(duì)海參酶解液進(jìn)行脫色工藝研究,以脫色率和多肽回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選合適的脫色劑,考察該脫色劑對(duì)海參多肽脫色效果的影響,并運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化,為海參多肽的分離純化及高值化利用提供參考。
1.1 材料與設(shè)備
鮮海參:青島市南山市場(chǎng);復(fù)配蛋白酶(35萬(wàn)U/g~40萬(wàn)U/g):南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;粉末活性炭、顆?;钚蕴浚荷畚漩紊繕I(yè)有限公司;硅藻土:上海市奉賢奉城試劑廠(chǎng);氫氧化鈉、濃硫酸、無(wú)水硫酸銅、乙酸鈉、乙酸、乙酰丙酮、37%甲醛、硫酸銨、對(duì)硝基苯酚:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;去離子水為中科院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。
電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS26型電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Sartorius BSA224S電子天平、Sartorius PB-10 pH計(jì):賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;紅外智能消化爐:上海沛歐分析儀器有限公司;TU-1810型紫外分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。
1.2 方法
1.2.1 工藝流程
海參→多肽酶解液制備→脫色→離心(4 000 r/ min,5 min)→0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾→檢測(cè)上清液
1.2.2 海參多肽酶解液的制備
取鮮海參勻漿,在40℃,加酶量4 000 U/g,時(shí)間4 h,PH 6.7,底物濃度為3%的酶解條件下,用復(fù)配蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)得海參多肽酶解液(89.8 g/L)。
1.2.3 脫色率
458 nm處測(cè)定脫色前后上清液的吸光度表征色值[13],按下列公式計(jì)算脫色率:
式中:A1為脫色前的吸光度值;A2為脫色后的吸光度值。
1.2.4 多肽回收率
采用Folin-酚法分別測(cè)定脫色前后海參多肽溶液中多肽含量[14],按下列公式計(jì)算:
式中:m1為脫色前多肽的含量,g;m2為脫色后多肽的含量,g。
1.2.5 脫色劑篩選
分別考察顆?;钚蕴俊⒎勰┗钚蕴亢凸柙逋翆?duì)海參多肽的脫色效果,在相同條件下(溫度50℃;時(shí)間30 min),以脫色率和多肽回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),選擇最佳的脫色劑。每種脫色劑分別做3次平行試驗(yàn),取平均值。
1.2.6 單因素條件確定
準(zhǔn)確配置一定濃度的海參多肽溶液于錐形瓶中,分別在不同的活性炭用量、時(shí)間、溫度、pH值條件下進(jìn)行脫色處理,結(jié)束后離心收集上清液,微孔濾膜過(guò)濾后按1.2.3及1.2.4方法測(cè)定脫色率及多肽回收率。單因素試驗(yàn)因素及水平表見(jiàn)表1。
表1 單因素試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of the single factor experiment
1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15],設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),見(jiàn)表2。采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,建立二次模型,根據(jù)模型預(yù)測(cè)最佳脫色條件并進(jìn)行驗(yàn)證。
表2 響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology
2.1 不同脫色劑對(duì)海參多肽脫色效果的影響
不同脫色劑對(duì)海參多肽脫色效果的影響見(jiàn)圖1。
由圖1可知,采用粉末活性炭、顆粒活性炭和硅藻土對(duì)海參酶解液進(jìn)行脫色處理,在相同的脫色劑用量、溫度和時(shí)間下,以粉末活性炭為脫色劑時(shí)的脫色率最高,硅藻土為脫色劑時(shí)的多肽回收率最高,綜合考慮脫色率和多肽回收率,本文選擇粉末活性炭作為海參酶解液的脫色劑,這與王書(shū)云等[16]在玉米多肽脫色工藝優(yōu)化研究中選取的脫色劑一致。
圖1 不同脫色劑對(duì)脫色效果的影響Fig.1 Influence of different bleaching agent on decoloring effect
2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響
不同活性炭用量對(duì)海參多肽脫色效果的影響見(jiàn)圖2。
圖2 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響Fig.2 Influence of activated carbon concentration on decoloring effect
由圖2可知,粉末活性炭用量對(duì)海參多肽樣品的脫色率有顯著的影響,當(dāng)活性炭用量在0.5 g/100 mL~2.5 g/100 mL的范圍內(nèi),脫色率隨著活性炭用量的增加而升高,但多肽回收率卻逐漸降低,可能是由于隨著粉末活性炭用量的增加,其比表面積增大,對(duì)多肽的吸附能力增強(qiáng),多肽回收率呈降低趨勢(shì)。活性炭用量超過(guò)1 g/100 mL以后,脫色率上漲趨勢(shì)變緩,而多肽回收率下降趨勢(shì)明顯。綜合考慮脫色率和多肽回收率,選擇粉末活性炭用量為1 g/100 mL。這與謝建華等[17]在青錢(qián)柳多糖活性炭脫色工藝中的活性炭用量一致。
2.2.2 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響
不同脫色時(shí)間對(duì)海參多肽脫色效果的影響見(jiàn)圖3。
由圖3可知,隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng),海參多肽酶解液的脫色率逐漸增大,然后趨于緩慢,但多肽回收率卻呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵诨钚蕴棵撋^(guò)程中,色素和海參多肽競(jìng)爭(zhēng)吸附活性炭,開(kāi)始活性炭對(duì)色素吸附較強(qiáng),當(dāng)達(dá)到30 min時(shí)色素吸附接近飽和,此時(shí)活性炭對(duì)多肽的吸附顯著增加,致使多肽回收率降低。綜合考慮脫色率和多肽回收率,本文選擇脫色時(shí)間為30 min。這與張璐等[18]在響應(yīng)面法優(yōu)化姜脯糖煮液活性炭脫色工藝中的活性炭最佳脫色時(shí)間一致。
圖3 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響Fig.3 Influence of time on decoloring effect
2.2.3 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響
不同脫色溫度對(duì)海參多肽脫色效果的影響見(jiàn)圖4。
圖4 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響Fig.4 Influence of temperature on decoloring effect
由圖4可知,在50℃之前,脫色率呈上升趨勢(shì),50℃后則呈顯著的下降趨勢(shì),這可能是由于溫度升高,使液體的傳質(zhì)速率增加,分子間擴(kuò)散加劇,色素易于滲透到活性炭多孔組織的內(nèi)部,吸附速率增大。當(dāng)溫度高于50℃時(shí),脫色溫度過(guò)高導(dǎo)致活性炭解吸附速率增加,從而導(dǎo)致脫色率降低。多肽回收率隨溫度的升高先增加后降低,變化不明顯。綜合考慮脫色率和多肽回收率,本文選擇脫色溫度為50℃。這與馬光亮等[19]在玉米朊的活性炭脫色工藝研究中的活性炭脫色最佳溫度一致。
2.2.4 pH值對(duì)脫色效果的影響
不同脫色pH值對(duì)海參多肽脫色效果的影響見(jiàn)圖5。
由圖5可知,隨著pH值升高,多肽溶液脫色率不斷減小,pH值對(duì)活性炭的脫色率具有顯著影響,在酸性范圍內(nèi)活性炭的脫色效果較好。這是由于活性炭吸附色素的過(guò)程需要H+的參與,所以提高樣品中H+的濃度,可以提高脫色率[8]。pH值高于3之后,隨著pH值的增加,脫色率呈急速下降趨勢(shì),而對(duì)多肽的回收率影響不大。綜合考慮脫色率和多肽回收率,本文選擇3.0為最佳脫色pH值。這與呂振磊等[20]在活性炭對(duì)紫貽貝蛋白酶解液脫色效果的影響中的活性炭脫色最佳pH值一致。
圖5 pH值對(duì)脫色效果的影響Fig.5 Influence of pH on decoloring effect
2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化海參多肽脫色工藝
2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果
響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,該模型Y1和Y2差異極其顯著(P<0.000 1),其決定系數(shù)R2值為0.995 4和0.926 4,失擬項(xiàng)P值均>0.05,表明海參多肽酶解液的脫色率和多肽回收率的試驗(yàn)值和擬合值之間具有很好的擬合度,所構(gòu)建的Y1、Y2的二次模型合適。
表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments
表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model
由表4回歸模型的方差分析可知:Y1的A、C、D、BC、BD、CD、A2、C2、D2對(duì)海參多肽溶液的脫色率影響顯著。一次項(xiàng)中各因素對(duì)海參多肽溶液的脫色率的影響顯著性大小順序是D>C>A;Y2的A、C、D、BC、CD、B2、C2對(duì)海參多肽溶液的多肽回收率影響顯著,一次項(xiàng)中各因素對(duì)海參多肽溶液的脫色率的影響顯著性大小順序是C>A>D。
擬合后可建立關(guān)于活性炭用量、時(shí)間、溫度以及pH的二次多項(xiàng)式回歸模型,為:
Y1/%=86.70+2.08A+0.017B+3.36C-5.54D-0.49AB-0.27AC+0.48AD-0.68BC-1.37BD-2.75CD-1.14A2-0.040B2+0.95C2-6.51D2
Y2/%=88.76-2.16A+0.71B-2.75C+0.83D+ 0.89AB+0.31AC-0.65AD+2.18BC+0.83BD+2.11CD-0.31A2-2.05B2-3.14C2+0.87D2
2.3.2 雙因素間交互作用影響
圖6 脫色率響應(yīng)曲面圖Fig.6 The response surface plot of the decoloring rate
Y1模型的時(shí)間與溫度、時(shí)間與pH值、溫度與pH的兩因素間交互作用對(duì)海參多肽溶液的脫色率影響見(jiàn)圖6。由圖6a可知,當(dāng)活性炭用量和pH值均處于最佳水平時(shí),固定溫度50℃左右,脫色率基本不隨時(shí)間變化;在溫度40℃~50℃之間,脫色率隨時(shí)間增加而緩慢增大;在溫度50℃~60℃之間,脫色率隨時(shí)間增加而緩慢減小。固定時(shí)間不變時(shí),脫色率隨溫度增加有較大幅度的增長(zhǎng)。由圖6b可知,當(dāng)活性炭用量和溫度均處于最佳水平時(shí),固定時(shí)間不變,脫色率隨pH值增加先緩慢增加后急速減小。固定pH值在3左右時(shí),脫色率基本不隨時(shí)間變化;pH值在1~3之間時(shí),脫色率隨時(shí)間增加而緩慢上升;pH值在3~5之間時(shí),脫色率隨時(shí)間增加而緩慢下降。由圖6c可知,當(dāng)活性炭用量和時(shí)間均處于最佳水平時(shí),固定溫度不變,脫色率隨pH值增大先緩慢上升后急速下降。pH值不變時(shí),脫色率隨溫度增加而呈現(xiàn)不同程度的上升。pH值在1~3之間時(shí),脫色率上升顯著,而pH值在3~5之間時(shí)則上升緩慢。
時(shí)間與溫度、溫度與pH值的兩因素間交互作用對(duì)海參多肽溶液的多肽回收率影響顯著見(jiàn)圖7。
圖7 多肽回收率響應(yīng)曲面圖Fig.7 The response surface plot of the peptide retention rate
由圖7a可知,當(dāng)活性炭用量和pH值均處于最佳水平時(shí),固定時(shí)間不變,多肽回收率隨溫度增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。時(shí)間在20 min~30 min之間時(shí),多肽回收率隨溫度增加先緩慢上升后急速下降;而時(shí)間在30 min~40 min之間時(shí),多肽回收率隨溫度增加先緩慢上升后緩慢下降。固定溫度不變,多肽回收率隨時(shí)間增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。溫度在40℃~50℃之間時(shí),多肽回收率隨溫度增加先緩慢上升后緩慢下降;溫度在50℃~60℃之間時(shí),多肽回收率隨溫度增加先急速上升后緩慢下降。由圖7b可知,當(dāng)活性炭用量和時(shí)間均處于最佳水平時(shí),固定溫度不變,且處于40℃~50℃之間時(shí),多肽回收率隨pH值增加呈現(xiàn)先緩慢下降后緩慢上升的趨勢(shì);溫度在50℃~60℃之間時(shí),多肽回收率隨pH值增加呈現(xiàn)急速上升趨勢(shì)。固定pH值不變,且處于1~3之間時(shí),多肽回收率隨溫度增加呈現(xiàn)急速下降趨勢(shì);pH值處于3~5之間時(shí),多肽回收率隨溫度增加先緩慢上升后緩慢下降。
2.3.3 海參多肽溶液脫色條件的確定及優(yōu)化工藝條件驗(yàn)證
經(jīng)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)可以得到海參多肽液脫色的最佳工藝條件,為:活性炭用量0.9 g/100 mL,時(shí)間31.56 min,溫度49.77℃,pH 2.18。在此最優(yōu)脫色工藝條件下,脫色率為87.47%,多肽回收率為88.97%。
為方便操作,將脫色條件設(shè)定為:活性炭用量0.9 g/ 100 mL,時(shí)間32 min,溫度50℃,pH 2.2。在此脫色條件下,脫色率和多肽回收率理論值分別為85.67%和88.62%。采用此脫色條件進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果為脫色率(85.39±2.25)%,多肽回收率(88.57± 1.86)%,可證明模型可靠。
以刺參為原料,經(jīng)復(fù)配蛋白酶酶解得海參多肽酶解液(89.8 g/L),以脫色率和多肽回收率為檢測(cè)指標(biāo),采用響應(yīng)面法優(yōu)化海參多肽脫色工藝,考察活性炭用量、時(shí)間、溫度、pH值對(duì)海參多肽溶液脫色效果的影響,以得到海參多肽最佳脫色工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)海參多肽溶液脫色進(jìn)行四因素三水平設(shè)計(jì),并采用Design Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。試驗(yàn)結(jié)果表明,活性炭用量、溫度和pH值對(duì)脫色率和多肽回收率均具有顯著影響。時(shí)間與溫度、時(shí)間與pH值、溫度與pH值之間的交互作用對(duì)脫色率有顯著影響;時(shí)間與溫度、溫度與pH值之間的交互作用對(duì)多肽回收率有顯著影響。響應(yīng)面法優(yōu)化脫色工藝最佳脫色條件為活性炭用量0.9 g/100 mL,時(shí)間32 min,溫度50℃,pH 2.2。在此最優(yōu)脫色工藝條件下,脫色率和多肽回收率理論值分別為85.67%和88.62%。3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為脫色率(85.39±2.25)%,多肽回收率(88.57±1.86)%,與理論值接近,模型可靠。該脫色工藝簡(jiǎn)單可靠,脫色效果好,多肽回收率高,為海參多肽產(chǎn)品后期研發(fā)提供理論依據(jù)。
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Optimization of Decoloring Process of Sea Cucumber Hydrolysates by Response Surface Methodology
HU Qing-ping1,2,3,PEI Dong1,2,JIANG Hong-mei4,ZHU Xiao1,2,WEI Jian-teng1,2,WANG Ning-li1,2,DI Duo-long1,2,*
(1.Center of Resource Chemical&New Material,Qingdao 266100,Shandong,China;2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,Gansu,China;3.Institute of Nutrition and Food Hygiene,F(xiàn)aculty of Public Health,Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China;4.Penglai Center for Disease Control and Prevention,Yantai 265600,Shandong,China)
In order to separate and purify the bioactive peptide,the color material of sea cucumber hydrolysates should be removed.The sea cucumber hydrolysates were made by enzyme hydrolysis.Based on the decoloring rate and peptide retention rate detected,the different bleaching agent was investigated,and the XX powder activated carbon was chosen as the best.Based on the results of single factor experiments,the decoloring process was optimized by response surface methodology.The results showed that the optimal conditions were as follows:the amount of activated carbon 0.9 g/100 mL,time 32 min,temperature 50℃,pH 2.2.Under this optimal condition,the decoloring rate was(85.39±2.25)%,the peptide retention rate was(88.57±1.86)%which was not significant with the theoretical value.
sea cucumber hydrolysates;activated carbon;decoloring;response surface methodology
2016-12-13
國(guó)家自然科學(xué)基金(21605149);中科院STS項(xiàng)目(KFJSW-STS-146);青島市民生計(jì)劃(15-9-2-97-nsh)
胡慶蘋(píng)(1989—),女(漢),碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。
*通信作者
10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.016