唐海波 ， 陳鳳蓮 ， 饒桂波 ， 姜佳佳 ， 孟 菲 ， 白安斌 ， 楊 磊 ， 吳健敏

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室 ， 廣西南寧530001)

竹鼠源致病性雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定

唐海波 ， 陳鳳蓮 ， 饒桂波 ， 姜佳佳 ， 孟 菲 ， 白安斌 ， 楊 磊 ， 吳健敏

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室 ， 廣西南寧530001)

為確定南寧隆安縣某竹鼠養(yǎng)殖場發(fā)生竹鼠死亡的原因，從發(fā)病的竹鼠肝、肺及腎臟中分離得到2株可疑細菌, 經形態(tài)觀察及16S rRNA 序列分析，鑒定兩株細菌均為雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)。經小鼠回歸試驗證實該分離菌可致死小鼠。測序結果顯示，該菌16S rRNA與雷氏普羅威登斯菌(AB680422)同源性高達99.9%。藥敏試驗顯示，對頭孢吡肟、頭孢唑林、頭孢氨芐等藥物高度敏感；對青霉素、氯霉素、氟苯尼考、復方新諾明等藥物有抗性。這些研究結果表明，雷氏普羅威登斯菌是隆安縣某竹鼠養(yǎng)殖場竹鼠致死的病原菌。本文在國內外首次報道了雷氏普羅威登斯菌對竹鼠有較強的致病性。

竹鼠 ； 雷氏普羅威登斯菌 ； 分離鑒定

竹鼠，亦稱竹貍、竹根鼠、茅根鼠等，在人工養(yǎng)殖類動物中，竹鼠是最耐粗食的經濟類動物之一。其體大肉多，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有較高的經濟價值。竹鼠在中國已被大規(guī)模養(yǎng)殖，成為具有經濟效益的養(yǎng)殖產業(yè)之一。廣西是我國竹鼠養(yǎng)殖量最大的省份，廣西桂林、南寧、柳州、河池等地均已建立有竹鼠養(yǎng)殖基地(場)。在國內，竹鼠已進入西南地區(qū)大中城市和城鎮(zhèn)的消費市場，據不完全統(tǒng)計，廣西、廣東、香港、海南、福建、四川、湖南、上海等地每年消費竹鼠600多萬只，且需求量以每年3%的速度遞增，全國竹鼠的生產量遠遠不能滿足市場急劇增長的需要。

作為一項僅發(fā)展10多年的新型養(yǎng)殖產業(yè)，竹鼠規(guī)?；B(yǎng)殖起步較晚，馴化時間不長，無論在飼養(yǎng)、繁殖還是疫病防控方面均存在許多亟待研究的問題，特別是在進行規(guī)模養(yǎng)殖后，隨著養(yǎng)殖方式的改變，竹鼠生活習性、機體性能等方面也隨之發(fā)生變化，從而引發(fā)出許多疾病。隨著竹鼠產業(yè)的不斷發(fā)展，對其疫病病原及防控技術開展系統(tǒng)性研究已迫在眉睫。已知竹鼠的病原包括細菌、病毒、真菌及寄生蟲。其中，細菌疾病最為常見，已報道的有大腸桿菌、巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌、鏈球菌等[1-4]。但是沒有關于雷氏普羅威登斯菌引起竹鼠發(fā)病的報道。

1 材料與方法

1.1 采樣及病理觀察 2015年3月，廣西南寧隆安縣某竹鼠養(yǎng)殖場發(fā)生竹鼠死亡，病鼠被毛粗亂，消瘦，肛門糞便粘著。剖檢癥狀：腸道出血并伴有大量膠胨樣滲出物；肺出血、間質增寬；肝臟色淺、偏黃；腎臟腫大、出血。肉眼觀察大體病理損傷后，取心、肝、脾、肺、腎及小腸，用中性福爾馬林[5]進行固定后，送洛陽中科基因檢測診斷中心進行切片與組織病理學觀察。

1.2 主要試劑和實驗動物 5%山羊鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、常規(guī)試劑為實驗室自制；膠回收試劑盒、PCRmix，購自北京康為世紀公司；DS 2000 DNA Marker，購自廣州東盛生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司; 4周齡的昆明系小鼠，購自廣西醫(yī)科大學。

1.3 細菌分離純化 分別采集病死竹鼠的心、肝、肺、腎及腸道滲出物，接種5%鮮血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，挑選形態(tài)特征一致的單個菌落反復劃線純化培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形態(tài)特征，并分別挑取單個菌落進行革蘭染色、鏡檢。根據菌落、菌體形態(tài)、染色特性進行初步判定，然后將典型菌落接種于營養(yǎng)瓊脂，進行純化培養(yǎng)備用。

1.4 16S rRNA基因序列測定及分析 取分離純化菌按細菌基因組抽提試劑盒說明書提取DNA，以提取的DNA模板，利用16S rRNA 基因擴增引物(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′/5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′)[6]進行PCR擴增；PCR反應條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，33個循環(huán)；72 ℃ 7 min；回收PCR 產物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，利用BLAST 進行同源性比對，采用MEGA 5.0 的Neighbor-Joing(NJ)[7]法構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 藥物敏感性檢測 采用Kirby-Bauer 瓊脂擴散法測量抑菌圈直徑(IZD)，進行3個重復，取平均值。依據CLSI 的抗菌藥物敏感性試驗標準，判定分離菌株對藥物的敏感性。

1.6 分離菌對小鼠的致病性試驗 取體重18～22 g健康昆明系小鼠，分為試驗組和對照組，每組各5只，試驗組按照7.1×107CFU/mL濃度，每只小鼠腹腔接種菌液0.2 mL，對照組腹腔接種等量滅菌肉湯培養(yǎng)基，隔離飼養(yǎng)。注射后連續(xù)觀察記錄小鼠發(fā)病死亡情況，剖檢發(fā)病死亡小鼠，并從內臟器官中分離細菌。

2 結果

2.1 竹鼠發(fā)病情況及剖檢病變 該養(yǎng)殖場位于廣西南寧隆安縣南圩鎮(zhèn)，遠離村屯，已有3年養(yǎng)殖時間，共存欄800多只。半個多月前開始發(fā)病，幼鼠、成年鼠均有死亡，主要癥狀是精神沉郁，食欲下降，體況偏瘦，肛門糞便粘著，陸續(xù)死亡，累計死亡共22只。部分組織器官病變如中插彩版圖1所示，兩側肺葉有出血點、出血斑，肺間質增寬；腸道出血并伴有大量膠胨樣滲出物；肝臟顏色變淺、變黃，腎臟腫大、出血。

2.2 發(fā)病竹鼠病理組織學變化 上述病變組織器官經切片后進行組織病理學觀察。H.E.染色結果如中插彩版圖2所示，肺泡內有大量紅細胞聚集，肺間質增寬，有炎性細胞侵潤；腸黏膜脫落，杯狀細胞增多，內有部分漿液性滲出物；肝內有大量脂肪泡，并有炎性細胞，部分血管有白細胞聚集，形成血管套；腎小球腫脹，腎小管出血，內有大量紅細胞。

2.3 細菌分離培養(yǎng)結果 從發(fā)病竹鼠的肝、肺、腎分離到兩株革蘭陰性菌，挑取典型的菌落進行純化培養(yǎng)觀察，可見分離菌株在TSA平板上形成表面光滑、邊緣整齊、圓形隆起的白色菌落。革蘭染色為兩端鈍圓，無芽孢，無莢膜，多數單個存在的革蘭陰性桿菌。

2.4 分離菌16S rRNA基因的擴增及序列分析 分離菌株PCR產物測序和序列分析發(fā)現，所獲得的DNA片段為1 200 bp左右，同源性比對顯示，兩株分離菌16S rRNA基因100%同源，與雷氏普羅威登斯菌 NR_042413、AB680422等菌株16S rRNA基因存在99.6%～99.9%的同源性。進一步將其與GenBank 中登錄的雷氏普羅威登斯菌菌株的16S rRNA 序列進行比對分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，進化樹顯示，該分離菌與AB680422株遺傳關系最近，處于同一小分支上。結合分離菌株的形態(tài)特征，確定分離株為雷氏普羅威登斯菌，并將其命名為15-11-3/7。

圖3 分離菌16S rRNA 基因進化樹

2.5 分離菌藥敏特性試驗結果 對分離菌株進行藥敏檢測，結果見表1。分離菌對頭孢吡肟、頭孢唑林、頭孢氨芐、亞胺培南等4種藥物高度敏感；對多黏菌素，鏈霉素，恩諾沙星，慶大霉素，氧氟沙星，萬古霉素，阿奇霉素，環(huán)丙沙星，林可霉素等9種藥物中度敏感；對青霉素、氯霉素、氟苯尼考、復方新諾明、磺胺異惡唑等5種藥物有抗性。

表1 雷氏普羅威登斯菌15-11-3/7藥敏試驗結果

2.6 致病性試驗結果 小鼠腹腔接種攻毒試驗結果顯示，試驗組小鼠在攻毒4 h后出現精神沉郁，呼吸急促，攻毒24～36 h后全部死亡，對照組小鼠均健活。剖檢死亡小鼠，發(fā)現肝臟變色、腎臟腫大、腸系膜淋巴結出血。將從死亡小鼠內臟器官中分離到的細菌進行革蘭染色，鏡檢顯示分離菌與接種菌是一致的細菌。

3 討論

本試驗從患病的竹鼠內臟分離到兩株細菌?；诜蛛x菌的形態(tài)學觀察及16S rRNA序列分析，確定兩株致病菌均為雷氏普羅威登斯菌。該菌16S-rRNA基因序列與雷氏普羅威登斯菌(AB680422)同源性高達99.9%，且遺傳關系最近，處于同一小分支上。這是國內外首次從竹鼠體內分離到雷氏普羅威登斯菌。

雷氏普羅威登菌屬腸桿菌科、普羅威登斯菌屬，是人獸共患的條件性致病菌，廣泛分布于土壤、水體、下水道等自然環(huán)境以及蒼蠅、鳥、貓、狗、牛、羊等的體表或腸道[8]。2006年衛(wèi)生部把它列入人間傳染的病原微生物名錄。在人體主要可致人泌尿系統(tǒng)及腸道外感染，并引起感染醫(yī)院的暴發(fā)流行。已報道引起人和動物尿路感染、傷口感染、眼結膜炎、腹瀉、肺炎等多種病癥[9-11]。食物在加工、運輸、銷售過程中很容易受該菌污染，引起食物中毒事件[12]。該菌也是一種動物的條件致病菌，戰(zhàn)文斌等[13]首次從國內發(fā)病對蝦中分離出該菌，王建昌等[15]報道了從進口美國種豬新鮮糞便樣品中分離到雷氏普羅威登斯菌，秦毅斌等[16]從腹瀉的仔豬內臟器官中分離到了該菌。雷氏普羅威登斯菌的致病機理比較復雜，對竹鼠所造成的疾病和癥狀，未曾報道。本試驗分離得到的雷氏普羅威登斯菌，經接種小鼠顯示了很強的致病性，這對竹鼠相關疾病的防治具有重要意義。

[1] 曾元根，鄧治邦. 中華竹鼠大腸桿菌病診斷與防制[J]. 動物醫(yī)學進展, 2002, 23(3)：94-95.

[2] 劉歡，蘇丹萍，陳敏鴻，等. 竹鼠巴氏桿菌病的診治[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2009, 36(10)：165-167.

[3] 馬磊，顏其貴，萬莉，等. 竹鼠肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J]. 中國人獸共患病學報, 2011 , 27 (9): 825-827.

[4] 祝宇，時永強，王奇惠，等. 竹鼠沙門氏菌與鏈球菌混合感染的診斷[J]. 中獸醫(yī)學雜志，2016, 4: 49-51.

[5] 張寶元. 10%福爾馬林與中性福爾馬林的比較[J]. 四川解剖學雜志，2001, 9(2)：97.

[6] 謝彬，袁潔，袁書智，等. 豬源綠色氣球菌的分離鑒定與藥敏特性研究[J]. 中國微生態(tài)學雜志，2010,25(3): 238-243.

[7] Tamura K, Peterson D, Peterson N,etal. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2 731-2 739.

[8] Ramkumar R, Ravi M, Jayaseelan C,etal. Description of Providencia vermicola isolated from diseased Indian major carp, Labeo rohita (Hamilton, 1822)[J]. Aquaculture, 2014, 420-421；193-197.

[9] Jim Manos, Robert Belas. The Genera Proteus, Providencia, and Morganella[J]. The Prokaryotes, 2006, 6: 245-269.

[10] Wang X, Wang J, Hao H,etal. Pathogenic Providencia alcalifaciens strain that causes fatal hemorrhagic pneumonia in piglets[J]. Curr Microbiol, 2014, 68 (3):278-284.

[11] Koreishi A F, Schechter B A, Karp C L. Ocular infections caused by Providencia rettgeri[J]. Ophthalmology, 2006, 113(8):1 463-1 466.

[12] Murata T, Iida T, Shiomi Y,etal. A large outbreak of foodborne infection attributed to Providencia alcalifaciens[J]. J Infect Dis, 2001, 184(8):1 050-1 055.

[13] 戰(zhàn)文斌，周麗，陳章群，等. 一種新的對蝦病原菌——雷氏普羅威登斯菌[J]. 中國水產科學，1997,4(1): 38-44.

[14] 王建昌，姜彥芬，王金鳳，等. 豬源性bla_(NDM-1)陰性雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定[J]. 中國動物檢疫, 2015,32(4): 22-25.

[15] 秦毅斌，何穎，盧冰霞，等. 仔豬雷極氏普羅菲登斯菌的分離鑒定及系統(tǒng)進化分析[J]. 動物醫(yī)學進展, 2015, 36(3): 35-40.

Isolation and identification of Providencia rettgeri from the diseased Bamboo rats

TANG Hai-bo , CHEN Feng-lian , RAO Gui-bo , JIANG Jia-jia , MENG Fei , BAI AN-bin , YANG Lei , WU Jian-min

(Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China)

To determine the pathogenic bacteria infecting the bamboo rats in the Longan of Nanning, two strains were isolated from the lung, liver and kidney of diseased bamboo rats. Identification by the morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis, demonstrated that the pathogenic bacteria were Providencia rettgeri. The pathogenic test showed that the isolate was highly pathogenic to the adult mice. Their 16S rRNA was closely related to Providencia rettgeri (AB680422) with a homology of 99.9%. The susceptibility test to antibiotis demonstrated that the Providencia rettgeri was highly sensitive to cefepime, cefazolin, cephalexin, etc., and resistant to penicillin, chloramphenicol, florfenicol, compound sulfamethoxazole, etc. These findings suggest that Providencia rettgeri is the pathogen of the dead bamboo rats in Longan of Nanning. This is the first report, showing that Providencia rettgeri has strong pathogenicity to bamboo rats at home and abroad.

Bamboo rat ; Providencia rettgeri ; Isolation and identification

WU Jian-min

2016-10-25

廣西水產畜牧局科技推廣應用項目(桂漁牧科201452004); 廣西基本科研業(yè)務費專項(桂科專項15-4)

唐海波(1983-)，男，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病防治與分子病毒學研究，E-mail：thb514@163.com

陳鳳蓮(1972-)，女，研究員，碩士，主要從事分子病毒學和動物傳染病研究，E-mail：c11212003@sina.com

吳健敏，E-mail：wu-jm20@163.com

S864.7

A

0529-6005(2017)07-0035-03

注：陳鳳蓮與唐海波對本文具有同等貢獻