劉欽成，張梓朗，潘潤華，劉寧，韓曉玉，郭凌宏，王春明，廖彩仙

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515)

大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞過程中Klf4、Nanog基因的表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化觀察

劉欽成，張梓朗，潘潤華，劉寧，韓曉玉，郭凌宏，王春明，廖彩仙

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515)

目的 觀察大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞過程中Klf4、Nanog基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化變化。方法 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞在體外用25 μg/L重組人肝細(xì)胞生長因子和0.1 nmol/L地塞米松誘導(dǎo)其分化，在誘導(dǎo)第0、7、14天分別提取細(xì)胞DNA和RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Klf4、Nanog基因mRNA，甲基化特異性PCR法觀察Klf4、Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化。結(jié)果 與誘導(dǎo)第0天比較，第7、14天Klf4 mRNA相對表達(dá)量降低(P均<0.05)；與誘導(dǎo)第0天比較，第7、14天Nanog mRNA相對表達(dá)量均降低(P均<0.05)。與誘導(dǎo)第0天比較，誘導(dǎo)第7天Klf4啟動(dòng)子區(qū)第1、2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高(P均<0.05)；與誘導(dǎo)第7天比較，誘導(dǎo)第14天Klf4啟動(dòng)子區(qū)第1個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高，第2、3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率降低,P均<0.05。與誘導(dǎo)第0天比較，誘導(dǎo)第7天Nanog啟動(dòng)子區(qū)第1個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率降低，第2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高，P均<0.05；與誘導(dǎo)第7天比較，誘導(dǎo)第14天Nanog啟動(dòng)子區(qū)第1個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高，第2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率降低，P均<0.05。結(jié)論 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞在體外誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化過程中，Klf4、Nanog基因表達(dá)隨誘導(dǎo)時(shí)間增加呈現(xiàn)先下降后回升趨勢，兩者啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化程度隨誘導(dǎo)時(shí)間增加出現(xiàn)不同程度變化；Klf4和Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化變化不僅會影響Klf4、Nanog基因的表達(dá)，而且起到重要的調(diào)控作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；CD90+Lin-骨髓細(xì)胞；Nanog基因；Klf4基因

CD90+Lin-骨髓細(xì)胞具有分化形成肝細(xì)胞的潛能已得到實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)[1，2]，但其向肝細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本課題組潘潤華等[3]曾對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化過程中OCT4基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)OCT4表達(dá)量和啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率隨分化進(jìn)程不同而變化。而Oct4與Klf4、Nanog等是一組多潛能性基因，在維持干細(xì)胞的多能性方面均起著重要作用[4，5]。本研究觀察了大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞過程中Klf4、Nanog基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化，以期從多角度認(rèn)識骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 高糖DMEM F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；澳洲特級胎牛血清(以色列BioInd 公司)；青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司)；0.25%胰酶-EDTA(美國Gibco公司)；重組人肝細(xì)胞生長因子(美國Peprotech公司)；EpiTect Bisulfite Kit(德國Qiagen公司)；TaKaRa EpiTaq HS(Takara公司)；Biospin細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技公司)；Gel Extraction膠回收試劑盒(Omega公司)；Glodview(廣州展晨生物科技公司)；RNasin特異性核糖核酸酶抑制劑(Promega公司)；DL 2 000 bp Marker(Takara公司)；TRIzol RNA提取試劑(Takara公司)；Diethy pyrocarbonate；DEPC(Sigma公司)；RT-PCR試劑(DBI公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI公司)。

1.2 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化 ①細(xì)胞培養(yǎng)：參照課題中黎冠宏等[4]方法獲得大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞，并將新鮮制備的細(xì)胞置于液氮中保存?zhèn)溆?。②凍存?xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)：凍存的大鼠 CD90+Lin-骨髓細(xì)胞復(fù)蘇后，將其置于37 ℃含5%CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為高糖培養(yǎng)液(高糖DMEM F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+青霉素-鏈霉素)，3 d換液1次，細(xì)胞生長到約80%時(shí)用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。③細(xì)胞誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)分化采用課題組中潘潤華等[3]報(bào)道的方案。把細(xì)胞培養(yǎng)至第三代的良好細(xì)胞，置入培養(yǎng)液(高糖DMEM F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+青霉素-鏈霉素+25 μg/L重組人肝細(xì)胞生長因子+0.1 nmol/L地塞米松)中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，3 d換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)14 d。在第0、7、14天用顯微鏡記錄細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)取未誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對照。

1.3 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Klf4、Nanog基因mRNA檢測方法 采用熒光定量PCR法。按照RNA提取試劑盒方法(TRIzol+氯仿+異丙醇提取法)從培養(yǎng)至第0、7、14天的大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞中提取總RNA。把1 μg的總RNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系依照熒光定量PCR試劑說明書所配制，合成cDNA的第一鏈。定量熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL、Bestar?SybrGreen qPCRmasterMix 10 μL、cDNA模板1 μL、PCR Reverse Primer 0.5 μL、ddH2O 8 μL，一共20 μL。使用美國安捷倫Mx3000P熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。PCR結(jié)果則依照2-ΔΔCt相對定量法計(jì)算，ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct；ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組的目的基因ΔCt-參照組的目的基因ΔCt；相對樣品初始模板量=2-ΔΔCt。GAPDH為內(nèi)參基因，GAPDH上游引物：5′-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3′，下游引物：5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′，片段長度為169 bp；Klf4上游引物：5′-GGAGACCGAGGAGTTCAACGAT-3′，下游引物：5′-AGGATGAAGCTGACGCCGAG-3′，片段長度為113 bp；Nanog上游引物：5′-AACGCTGCTCCGCTCCATAA-3′，下游引物：5′-GGCTTCCAAATTCGCCTCCAAA-3′，片段長度為102 bp。

1.4 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Klf4、Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化觀察方法 ①DNA提取及甲基化修飾：按照細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說明書，從誘導(dǎo)第0、7、14天大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞中提取基因組DNA。然后使用EpiTect Bisulfite Kit試劑盒，按照說明將試劑添加在200 μL的PCR管中建立亞硫酸氫納反應(yīng)體系，使用PCR儀進(jìn)行熱循環(huán)將樣本DNA亞硫酸氫鹽修飾化。熱循環(huán)條件：95 ℃變性5 min，60 ℃孵化25 min，95 ℃變性5 min，60 ℃孵化85 min，95 ℃變性5 min，60 ℃孵化175 min，20 ℃保持冷卻。修飾純化后的DNA置于-80 ℃條件下保存。②引物選取及PCR擴(kuò)增：選取Klf4、Nanog基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游+1～-1 500 bp附近的啟動(dòng)子區(qū)，分別含3個(gè)和2個(gè)CpG位點(diǎn)。Klf4、Nanog的引物設(shè)計(jì)均由上海生工生物技術(shù)有限公司所合成，其甲基化引物信息如下：Nanog-MF1：5′-AGTTGGTAGTTGAGAGGATAATTAC-3′，5′-Nanog-MR1：TAAACATTCTAAATAATTCCTCTAT-3′；Nanog-MF2：5′-TGAATTAGTAGTTTTTATTTTATTC-3′，Nanog-MR2：5′TACTAAACTCCTCACTAACACTAAA-3′；Klf4-MF1：5′-ATTAATATAGGTTTTAGGATTTCGG-3′，Klf4-MR1：5′-AACAACGTATACGTATACACTCGTT-3′；Klf4-MF2：5′-ATTTCGGGATTTAAATAGGTGAAAC-3′，Klf4-MR2：5′-ACTAATTAATGCTCCAGCCCAAACA-3′；Klf4-MF3：5′-TTAAATAGGTGAAACGATAGAGGAC-3′，Klf4-MR3：5′-TCACGATTAAACCCCCTAACTAAAA-3′。在0.2 mL PCR反應(yīng)管中配制目的基因PCR擴(kuò)增體系25 μL：TaKaRa EpiTaq HS 0.25 μL、10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL、dNTP Mix 3 μL、MgCl22.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、甲基化修飾純化后DNA 1 μL、ddH2O 18.25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，51～61 ℃退火30 s(具體溫度由引物決定)，72 ℃延伸30 s，如此共循環(huán)30次。72 ℃延伸5 min，冷卻至4 ℃保存。取5 μL PCR的產(chǎn)物來行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果

2.1 大鼠 CD90+Lin-骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 復(fù)蘇后的細(xì)胞分布均勻，形態(tài)均一，呈橢圓形。48 h后貼壁生長，呈長梭形，集落呈漩渦狀。細(xì)胞形態(tài)在誘導(dǎo)分化過程中逐漸變圓，至第14天時(shí)，細(xì)胞呈飽滿圓形。

2.2 大鼠 CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Klf4、Nanog基因mRNA相對表達(dá)量比較 誘導(dǎo)第0、7、14天Klf4 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.04、0.31±0.01、0.94±0.01，Nanog mRNA相對表達(dá)量分別為0.94±0.08、0.46±0.04、0.57±0.04，第0天、第7天比較，第7天、第14天比較，P均<0.05。

2.3 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Klf4啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化頻率比較 結(jié)果見表1。

2.4 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Nanog啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化頻率比較 結(jié)果見表2。

表1 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Klf4啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化頻率比較(%)

注：與誘導(dǎo)第0天比較，*P<0.05；與誘導(dǎo)第7天比較，△P<0.05。

表2 大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞Nanog啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化頻率比較(%)

注：與誘導(dǎo)第0天比較，*P<0.05；與誘導(dǎo)第7天比較，△P<0.05。

3 討論

Klf4和Nanog在干細(xì)胞分化、增殖、維持自我更新和維持多能性等方面起重要作用，但兩者的作用又不完全相同。Klf4參與調(diào)節(jié)Wnt[6]、Notch[7]、TGF-β[8]等多種重要信號通路，在干細(xì)胞分化中起重要作用。Takahashi等[9]運(yùn)用Klf4協(xié)同Oct4、Sox2及c-Myc轉(zhuǎn)錄因子，成功將小鼠胚胎和成體成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。有研究[4]表明，Klf4可結(jié)合于Lefty1啟動(dòng)子并促進(jìn)Lefty1基因表達(dá)，從而促進(jìn)Oct4及Sox2干細(xì)胞性因子的表達(dá)。Klf4還可調(diào)控p21的表達(dá)，在細(xì)胞周期中阻止G1/S期的進(jìn)程以至于達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖[10,11]。Klf4處于STAT3通路的下游，該通路激活后可上調(diào)Klf4的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)干細(xì)胞自我更新的目的[12]。Nanog在胚胎干細(xì)胞中，有著維持自我更新以及多能性的功能，同時(shí)也是干細(xì)胞自我更新、增殖并保持其分化潛能所必需的[13]。Yu等[14]用Nanog、Oct4、Sox2、Lin28共4種多能性因子成功使人體細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能性干細(xì)胞，充分表明了Nanog在干細(xì)胞多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的地位。關(guān)于Nanog自我更新的機(jī)制，研究[15]表明其可通過調(diào)節(jié)下游靶向基因gata6、gata4來維持干細(xì)胞自我更新。

在多能性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Klf4和Nanog又是有聯(lián)系的。例如Klf4先與Oct4、Sox2結(jié)合，形成Oct4/Sox2/Klf4復(fù)合體，然后復(fù)合體再結(jié)合于Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[16]。在胚胎干細(xì)胞中，Klf4不僅可以聯(lián)合PBX1直接作用于Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)節(jié)其表達(dá)[17]。而且Klf4還可以通過直接抑制p53的表達(dá)，從而間接調(diào)控了Nanog基因表達(dá)[18]。但在成體干細(xì)胞的橫向分化過程，Klf4和Nanog的調(diào)控作用和調(diào)控機(jī)理均未完全明了。

本研究顯示，誘導(dǎo)第0、7、14天，Klf4、Nanog mRNA相對表達(dá)量先下降后回升。牛朝詩等[19]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)呈低甲基化狀態(tài)，Nanog表達(dá)量明顯上調(diào)；而袁旦平等[20]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織的Klf4基因啟動(dòng)子區(qū)明顯較正常癌旁組織甲基化程度高，結(jié)腸癌組織Klf4的表達(dá)量明顯下降。上述兩者研究對象均為腫瘤細(xì)胞，而本文則是針對大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的過程中Klf4和Nanog的變化，結(jié)果顯示最終兩者表達(dá)量均較原始有所下降，這表明成熟肝細(xì)胞多能性下降。但是在此過程中兩者表達(dá)量并非呈現(xiàn)單方向線性下降，單方向僅上調(diào)或下降Klf4、Nanog的表達(dá)可能會導(dǎo)致細(xì)胞像上述腫瘤細(xì)胞方向發(fā)展。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)主要的修飾方式之一，基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化變化是調(diào)控基因表達(dá)的一個(gè)重要方式。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在CpG二核苷酸5′端胞嘧啶第5位碳原子插入一個(gè)甲基集團(tuán)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的反應(yīng)。本文結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)第0天比較，誘導(dǎo)第7天Klf4啟動(dòng)子區(qū)第1、2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高；與誘導(dǎo)第7天比較，誘導(dǎo)第14天Klf4啟動(dòng)子區(qū)第1個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高，第2、3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率降低。與誘導(dǎo)第0天比較，誘導(dǎo)第7天Nanog啟動(dòng)子區(qū)第1個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率降低，第2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高；與誘導(dǎo)第7天比較，誘導(dǎo)第14天Nanog啟動(dòng)子區(qū)第1個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率升高，第2個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率降低。上述結(jié)果提示，Klf4、Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化變化不僅會影響Klf4、Nanog的表達(dá)，還可能會影響到其他與分化有關(guān)基因的表達(dá)，在體外誘導(dǎo)大鼠CD90+Lin-骨髓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中很可能起重要的調(diào)控作用。

[1] Liao X, Ancheng JY, Zhou QJ, et al. Therapeutic effect of autologous bone marrow-derived liver stem cells transplantation in hepatitis B virus-induced liver cirrhosis[J]. Hepatogastroenterology, 2013,60(123):406-409.

[2] 秦安成,廖彩仙,王宇,等.自體骨髓源性肝干細(xì)胞移植治療肝炎后肝硬化的臨床研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(3):529-531.

[3] 潘潤華,阿斯楞,張茂,等.焦磷酸測序法檢測OCT4啟動(dòng)子在大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞分化中的甲基化變化[J].生命科學(xué)研究,2016,20(2):113-118.

[4] 黎冠宏,王薇,李繼業(yè),等.H3K27me2 在大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞分化過程中的變化[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,52(6):28-32.

[5] Li Y, McClintick J, Zhong L, et al. Murine embryonic stem cell differentiation is promoted by socs-3 and inhibited by the zinc finger transcription factor Klf4[J]. Blood, 2005,105(2):635-637.

[6] Zhang W, Chen X, Kato Y, et al. Novel cross talk of Krüppel-like factor 4 and beta-catenin regulates normal intestinal homeostasis and tumor repression[J]. Mol Cell Biot, 2006,26(6):2055-2064.

[7] Zheng H, Pritchard DM, Yang X, et al. KLF4 gene expression is inhibited by the notch signaling pathway that controls goblet cell differentiation in mouse gastronintestinal tract[J]. Am J Physiol Gastrointst Liver Physiol, 2009,296(3):490-498.

[8] Li HX, Han M, Bernier M, et al. Krüppel-like factor 4 promotes differentiation by transforming growth factor-beta receptor-mediated Smad and P38 MAPK signaling in vascular smooth muscle cells[J]. J Biol Chem, 2010,285(23):17846-17856.

[9] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006,126(4):663-676.

[10] Chen X, Johns DC, Geiman DE, et al．Krüppel-like factor 4(gut-enriched Krüppel-like factor) inhibits cell proliferation by blocking G1/S progression of the cell cycle[J]. J Biol Chem, 2001,276(32):30423-30428.

[11] Shie JL, Chen ZY, Fu M, et al. Gut-enriched Krüppel-like factor repress cyclin D1 promoter activity through Sp1 motif[J]. Nucleic Acids Res, 2000,28(15):2969-2976.

[12] Hall J, Guo G, Wray J, et al. Oct4 and LIF/Stat3 additively induce Krüppel factors to sustain embryonic stem cell self-renewal[J]. Cell Stem Cell, 2009,5(6):597-609.

[13] Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells[J]. Cell, 2003,113(5):631-642.

[14] Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluri potent stem cell lines derived from human somatic cells[J]. Science, 2007,318(5858):1917-1920.

[15] Zhong XM, Jin Y. Critical roles of coactivator p300 in mouse embryonic stem cell differentiation and Nanog expression[J]. J Biol Chem, 2009,284(14):9168-9175.

[16] Lee S, Wottrich S, Bonavida B. Crosstalks between Raf-kinase inhibitor protein and cancer stem cell transcription factors (Oct4, KLF4, Sox2, Nanog)[J]. Tumour Biol, 2017,39(4):1010428317692253.

[17] Chan KK, Zhang J, Chia NY, et al. KLF4 and PBX1 directly regulate NANOG expression in human embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2009,27(9):2114-2125.

[18] Choi MR, In YH, Park J, et al. Genome-scale DNA methylation pattern profling of human bone marrow mesenchymal stem cells in long-term culture[J]. Exp Mol Med, 2012,44(8):503-512.

[19] 汪炎,牛朝詩,李仲穎,等.膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測及意義[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2014,13(5):389-393.

[20] 曹躍鵬,龐紅雙,陳成,等.結(jié)腸癌組織KLF4基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其臨床意義[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2015,27(11):1448-1450.

Expression of Klf4 and Nanog and their promoter methylation during differentiation of rat bone marrow CD90+Lin-cells to hepatocytes

LIUQincheng,ZHANGZilang,PANRunhua,LIUNing,HANXiaoyu,GUOLinghong,WANGChunming,LIAOCaixian

(NanfangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective To observe the expression of Klf4 and Nanog and the promoter region CpG site methylation changes during differentiation of rat bone marrow CD90+Lin-cells to hepatocytes. Methods Rat bone marrow CD90+Lin-cells were induced in vitro by 25 μg/L recombinant human hepatocyte growth factor and 0.1 nmol/L dexamethasone. DNA and RNA were extracted from cells on day 0, 7, and 14 of induction. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect Klf4 and Nanog mRNA expression. Methylation Specific PCR was performed to detect methylation variation of CpG sites in Klf4 and Nanog promoters. Results Compared with the day 0, the relative expression of Klf4 mRNA decreased on day 7 and day 14 (P<0.05); compared with the day 0, the relative expression of Nanog mRNA decreased on day 7 and day 14 (P<0.05). Compared with the day 0, the methylation frequency of the first and second CpG sites in Klf4 promoter increased on day 7 (P<0.05); compared with the day 7, the methylation frequency of the first CpG site in Klf4 promoter increased on day 14, while the second and third CpG sites in Klf4 promoter decreased (P<0.05). Compared with the day 0, the methylation frequency of the first site in Nanog promoter decreased in day 7, while the second sites in Nanog promoter increased (P<0.05); compared with the day 7, the methylation frequency of the first CpG site in Nanog promoter increased on day 14, while the second CpG site in Nanog promoter decreased (P<0.05).Conclusions During differentiation of rat bone marrow CD90+Lin-cells to hepatocytes in vitro, the expression of Klf4 and Nanog first increases and then decreases as time passes, and the CpG sites methylated degrees of both promoters vary as time passes. The methylation of CpG site in the promoter region of Klf4 and Nanog not only affects the expression of Klf4 and Nanog, but also plays an important regulatory role.

bone marrow mesenchymal stem cells; bone marrow CD90+Lin-cells; Nanog gene; Klf4 gene

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B080701069)。

劉欽成(1992-)，男，在讀碩士，主要研究方向?yàn)楦魏透胃杉?xì)胞移植。E-mail： 276309233@qq.com

廖彩仙(1960-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)楦魏透胃杉?xì)胞移植。E-mail： liaocx@fimmu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.004

R394.2

A

1002-266X(2017)31-0013-04

2017-06-13)