張志國

（唐山三元食品有限公司，河北唐山301501）

低聚半乳糖指紋圖譜的構(gòu)建

張志國

（唐山三元食品有限公司，河北唐山301501）

構(gòu)建低聚半乳糖指紋圖譜，為低聚半乳糖生產(chǎn)工藝研究和質(zhì)量控制提供方法，為低聚半乳糖聚合度研究提供支持。利用離子色譜儀分離低聚半乳糖的分離度和靈敏度，構(gòu)建低聚半乳糖離子色譜指紋圖譜，并繪制商業(yè)化的低聚半乳糖離子色譜指紋圖譜。離子色譜的分離度和靈敏度非常適合低聚半乳糖指紋圖譜的繪制，利用離子色譜法繪制了商業(yè)化低聚半乳糖的指紋圖譜，并確定了低聚半乳糖離子色譜指紋圖譜的糊精指紋區(qū)，初步判定了低聚半乳糖組分聚合度。通過繪制低聚半乳糖指紋圖譜確定了商業(yè)化低聚半乳糖原料中含有15種以上的低聚半乳糖組分，不同公司生產(chǎn)的低聚半乳糖的指紋圖譜有顯著不同。

低聚半乳糖；指紋圖譜；離子色譜

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）在母乳低聚糖中含量是最高的，所以認(rèn)為低聚半乳糖是各種功能性低聚糖中益生功能比較強(qiáng)的一種益生因子[1-2]。

作為功能性低聚糖，低聚半乳糖主要具有如下的生理功能：促進(jìn)腸道雙歧桿菌的增殖，改善礦物質(zhì)元素的吸收和防止骨質(zhì)減少，預(yù)防、治療便秘；改善脂質(zhì)代謝，降低血清膽固醇的含量；生成營養(yǎng)物質(zhì)，改善營養(yǎng)狀況[3-5]。

在工業(yè)生產(chǎn)中，以乳糖為原料，利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用生產(chǎn)低聚半乳糖。通常，低聚半乳糖的分子結(jié)構(gòu)是在半乳糖或葡萄糖分子上通過β-D-（1→6）半乳糖苷鍵或β-D-（1→4）半乳糖苷鍵連接1個～7個半乳糖基，研究發(fā)現(xiàn)β-D-（1→3）半乳糖苷鍵也比較常見，也包含少數(shù)的β-D-（1→2）半乳糖苷鍵。因?yàn)槭且匀樘菫樵仙a(chǎn)，β-半乳糖苷酶的作用是可逆的，工業(yè)化的低聚半乳糖通常是葡萄糖、半乳糖、乳糖、半乳二聚糖、半乳三聚糖、半乳四聚糖、半乳五聚糖等的混合物。其中影響低聚半乳糖組分結(jié)構(gòu)和比例的主要因素在于低聚半乳糖生產(chǎn)時使用的β-半乳糖苷酶的來源及其生產(chǎn)工藝。已經(jīng)測得的低聚半乳糖不同聚合度的糖苷鍵結(jié)構(gòu)式超過15種，表1中列出了已經(jīng)測得的低聚半乳糖不同聚合度的糖苷鍵結(jié)構(gòu)式[3，6-10]。

低聚半乳糖組分比較復(fù)雜，研究人員仍然對低聚半乳糖組分功效、生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)用半乳糖苷酶的篩選進(jìn)行大量的研究，用來提高低聚半乳糖的生產(chǎn)效率、純度。繪制低聚半乳糖的指紋圖譜，盡可能分離低聚半乳糖的全部組分，可以為低聚半乳糖生產(chǎn)工藝的改進(jìn)研究和分子聚合度分布研究提供數(shù)據(jù)，為低聚半乳糖的質(zhì)量控制提供方法[11-12]。

表1 低聚半乳糖不同聚合度的糖苷鍵結(jié)構(gòu)式Table 1 Structural formula of glycosidic bond of different degree of polymerization in GOS

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

低聚半乳糖：唐山三元食品有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.5%）、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；果糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：貴州迪大科技有限責(zé)任公司；乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%）：上海時代生物科技有限公司；β-半乳糖苷酶（12 U/mg，500 kU/瓶）、乙酸鈉（99%）、氫氧化鈉（50%，1.515 g/mL）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

乙腈（色譜純）：天津市天昊化工有限公司；磷酸二氫鉀（色譜純）、三水磷酸氫二鉀（色譜純）、十二水磷酸氫二鈉（色譜純）、氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效離子色譜儀（ICS-5000，配脈沖安培檢測器PAD）、CarboPac PA200 Guard Column（3 mm×50 mm）、CarboPac PA200 Analytical Column（3 mm×250 mm）：美國Dionex公司；Millipore超純水處理裝置：美國Millipore公司；電子分析天平：梅特勒－托利多儀器公司；精密pH儀（PHS-3C）：南寧慶華化工有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

1）葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（濃度分別為1 mg/mL）：分別精密稱取6種糖的標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

2）葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（濃度分別為10 μg/mL）：分別吸取6種糖的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.0 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。

3）磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.0）：22.0 g磷酸二氫鉀和6.0 g三水磷酸氫二鉀溶于水中，稀釋至1 L。120℃高壓滅菌器中滅菌30 min。

4）鹽酸溶液（1 mol/L）：量取 83.0 mL濃鹽酸溶于超純水中，稀釋至1 L。

5）氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取40 g氫氧化鈉，用100 mL無二氧化碳超純水溶解，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用無二氧化碳超純水定容至刻度，儲存在具膠塞試劑瓶中。

6）β-半乳糖苷酶溶液（2 000 U/mL）：稱取活性約為12 U/mg的來源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的半乳糖苷酶16.67g，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液制成100mL、半乳糖苷酶最終活性為2 000 U/mL的溶液。在pH 4.5和25℃條件下，1個單位可將1.0 mol o-硝基苯基-D-半乳糖苷水解為o-硝基苯酚和D-半乳糖。混懸液不用時儲存于冰箱中。使用前充分振搖混懸液，酶混懸液制備后8 h內(nèi)使用。

7）乙腈溶液（20%）：量取200 mL乙腈，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

8）乙腈溶液（3%）：量取30 mL乙腈，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

9）氫氧化鈉溶液（250 mmol/L）：量取 50%氫氧化鈉溶液13.2 mL，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

10）乙酸鈉溶液（1mol/L）：精密稱取乙酸鈉 82.03g，用無二氧化碳超純水100 mL溶解轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

1.3.2 樣品處理

分別稱取低聚半乳糖原料0.100 0 g，用超純水溶解轉(zhuǎn)移到1 000 mL容量瓶中，并稀釋到刻度，搖勻，制成0.1 mg/mL的樣品待測溶液，用0.2 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 離子色譜條件

1）色譜柱：CarboPacPA200AnalyticalColumn（3mm×250 mm），保護(hù)柱 CarboPac PA200 Guard Column（3 mm×50 mm）；

2）色譜柱溫度：30℃；

3）流動相：洗脫梯度見表2；

4）流動相流量：0.4 mL/min；

5）PAD 靈敏度：3 μC；

6）進(jìn)樣量：20 μL；

7）在正式進(jìn)樣檢測前，按照梯度洗脫模式運(yùn)行，以0.4 mL/min流速穩(wěn)定基線，當(dāng)基線穩(wěn)定后即可進(jìn)樣。

采用CarboPac PA200分析柱分析低聚半乳糖的流動相梯度見表2。

表2 采用CarboPac PA200分析柱分析低聚半乳糖的流動相梯度Table 2 Eluent gradient of galactooligosaccharides analyzed by CarboPac PA200 analytical column with IC

續(xù)表2 采用CarboPacPA200分析柱分析低聚半乳糖的流動相梯度Continue table 2 Eluent gradient of galactooligosaccharides analyzed by CarboPac PA200 analytical column with IC

2 結(jié)果與討論

2.1 低聚半乳糖分離方法

構(gòu)建低聚半乳糖指紋圖譜，主要是要發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖組分和比例的復(fù)雜性，研究低聚半乳糖組分和比例的變化規(guī)律，為低聚半乳糖工藝研究和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。選擇離子色譜分離主要是因?yàn)殡x子色譜分離低聚半乳糖的效率要高于高效液相色譜，也有比較好的檢出限和靈敏度。在目前的分離技術(shù)水平下，CarboPac PA200色譜柱對低聚糖有好的分離效率，這一點(diǎn)是氨基柱、糖柱無法比的，在試驗(yàn)中也得到了證實(shí)。

在流動相比例的選擇上，因?yàn)闅溲趸c溶液可以比較好的分離單糖、低聚糖，而乙酸鈉可以把低聚糖、多聚糖成分有效的洗脫。所以用超純水、250 mmol/L氫氧化鈉、1 mol/L醋酸鈉作流動相，通過梯度洗脫和6種糖的標(biāo)準(zhǔn)品完成單糖、二糖、低聚糖的分離，并通過糊精的洗脫試驗(yàn)完成色譜柱的完全洗脫。

2.2 低聚半乳糖指紋圖譜構(gòu)建

用葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖6種糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液判斷低聚半乳糖原料中單糖和雙糖分離效果，以及低聚糖的分離效果，出峰順序依次是半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離結(jié)果Fig.1 Isolation of standard sample

圖2 低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜（樣品1）Fig.2 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 1）

圖3 低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜（樣品2）Fig.3 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 2）

圖4 添加糊精的低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜（樣品3）Fig.4 IC fingerprint of galactooligosaccharides including dextrin（sample 3）

用設(shè)定好的離子色譜條件，進(jìn)行了4批次不同公司生產(chǎn)的低聚半乳糖原料指紋圖譜的構(gòu)建，樣品2中添加了糊精形成樣品3，結(jié)果見圖2～圖6。

4批次低聚半乳糖原料中都分別檢出了含量不等的半乳糖、葡萄糖、乳糖，并且半乳糖、葡萄糖、乳糖在保留時間5 min～11.5 min內(nèi)出峰。除去乳糖和保留時間顯示為少量果糖的組分以外，保留時間在7.5 min～35 min內(nèi)的組分，進(jìn)過酶解試驗(yàn)證實(shí)超過15種的色譜組分為低聚半乳糖成分。對添加糊精的低聚半乳糖原料構(gòu)建指紋圖譜，結(jié)果表明保留時間在37 min～45 min為糊精的指紋圖譜區(qū)，見圖4。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)確認(rèn)，在確定的離子色譜條件下，分離低聚半乳糖原料時，如果在保留時間區(qū)間37 min～45 min內(nèi)出現(xiàn)連續(xù)有規(guī)律的、峰高規(guī)律性變小的一系列色譜峰時，即可判斷添加了糊精，必要時可以用添加糊精的低聚半乳糖做驗(yàn)證。

分析構(gòu)建的低聚半乳糖離子色譜指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，不同公司生產(chǎn)的低聚半乳糖在乳糖、半乳糖、葡萄糖含量上有明顯差異，乳糖、半乳糖、葡萄糖含量和比例直接影響了低聚半乳糖各組分的含量和比例，同時決定了低聚半乳糖組分的聚合度分布。

2.3 低聚半乳糖指紋圖譜的組分分析

對4批次低聚半乳糖原料指紋圖譜進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖7。

圖5 低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜（樣品4）Fig.5 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 4）

圖6 低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜（樣品5）Fig.6 IC fingerprint of galactooligosaccharides（sample 5）

圖7 4種低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜Fig.7 IC fingerprints of four kinds of galactooligosaccharides

通過對4批次低聚半乳糖進(jìn)行聚合度分析，并結(jié)合低聚半乳糖原料生產(chǎn)商提供的組分含量，可以初步判定低聚半乳糖各聚合度組分在離子色譜指紋圖譜的保留時間區(qū)間。聚合度為2的低聚半乳糖組分在保留時間為8 min～14 min，聚合度為3的低聚半乳糖組分在保留時間為14 min～22 min，聚合度為4的低聚半乳糖組分在保留時間為22 min～30 min，聚合度為5以上的低聚半乳糖組分在保留時間為30 min～37 min內(nèi)全部被洗脫出來。

對照4批次低聚半乳糖原料指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)11個主要色譜峰，分別在保留時間為8 min～14 min區(qū)間8.4 min的1號峰、9.9 min的2號峰和13.1 min的3號峰，保留時間為14 min～22 min區(qū)間的16.6 min的4號峰、17.7 min的5號峰，保留時間為22 min～30 min區(qū)間的24.9 min的6號峰、26.3 min的7號峰、28.1 min的8號峰、28.7min的9號峰，保留時間為30min～37min區(qū)間內(nèi)的32.4 min的10號峰、34.3 min的11號峰。

4個批次低聚半乳糖樣品的離子色譜指紋圖譜中，主要色譜組分分布見表3。

從表3中可以看出4個批次低聚半乳糖的組分含量既有共同點(diǎn)又有明顯區(qū)別，比如4批次低聚半乳糖全部含有較多的4號組分；樣品1中包含特有的8號組分；5號組分和7號組分是樣品2特有的，但是樣品2中6號組分含量很低；樣品4和樣品5含有較多的10號組分，是區(qū)別于其它樣品特有組分，這2個樣品中3號組分含量很低，兩個樣品2號組分、4號組分、6號組分、9號組分、10號組分的含量區(qū)別明顯，很容易區(qū)分。4批次不同公司生產(chǎn)的低聚半乳糖原料在離子色譜指紋圖譜中的組分區(qū)別明顯，能夠通過離子色譜指紋圖譜進(jìn)行區(qū)分辨別。

表3 不同公司生產(chǎn)的低聚半乳糖的主要離子色譜組分Table 3 Major IC composition of galactooligosaccharides produced by different company

2.3 不同生產(chǎn)工藝對低聚半乳糖色譜組分的影響

為了驗(yàn)證低聚半乳糖離子色譜指紋圖譜的應(yīng)用效果，采用新舊兩種生產(chǎn)工藝（生產(chǎn)用半乳糖苷酶不同）在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低聚半乳糖的生產(chǎn)，用離子色譜構(gòu)建兩種工藝生產(chǎn)的低聚半乳糖的指紋圖譜，結(jié)果見圖8。

圖8 不同工藝低聚半乳糖樣品的IC指紋圖譜對比Fig.8 Comparison of IC fingerprints of galactooligosaccharides of different technique

從圖8中可以看出，生產(chǎn)低聚半乳糖用的半乳糖苷酶不同，生產(chǎn)的2種低聚半乳糖指紋圖譜中離子色譜組分和含量比例有著明顯差異，從而可以用指紋圖譜法研究生產(chǎn)工藝對低聚半乳糖組分和比例的影響。

3 結(jié)論

低聚半乳糖指紋圖譜研究的目的是研究和控制低聚半乳糖的質(zhì)量，通過指紋圖譜的特征，既能有效考察低聚半乳糖主要特征峰的種類和含量，又可以通過構(gòu)建比如糊精等添加物的指紋區(qū)鑒別低聚半乳糖的質(zhì)量，還可以通過指紋圖譜的主要特征峰研究低聚半乳糖的益生功效。本次研究得出以下結(jié)論：

1）通過構(gòu)建低聚半乳糖的離子色譜指紋圖譜，確認(rèn)并發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖的復(fù)雜性，利用離子色譜分離低聚半乳糖共發(fā)現(xiàn)了超過15種組分。

2）通過對樣品進(jìn)行添加糊精的離子色譜分離試驗(yàn)，確認(rèn)了低聚半乳糖的糊精指紋圖譜區(qū)。

3）通過對比發(fā)現(xiàn)，低聚半乳糖原料中乳糖、半乳糖、葡萄糖含量和比例直接影響了低聚半乳糖中各個組分的含量和比例，同時決定了低聚半乳糖組分的聚合度分布。

4）結(jié)合聚合度研究，初步得到了低聚半乳糖各聚合度組分在離子色譜指紋圖譜的保留時間區(qū)間。

5）通過對4批次低聚半乳糖原料在離子色譜指紋圖譜中的組分對比發(fā)現(xiàn)，主要特征峰有明顯區(qū)別，能夠通過離子色譜指紋圖譜進(jìn)行區(qū)分辨別不同公司生產(chǎn)低聚半乳糖。

6）利用不同半乳糖苷酶生產(chǎn)低聚半乳糖，得到了有明顯區(qū)別的指紋圖譜，確認(rèn)了不同生產(chǎn)工藝對低聚半乳糖各組分含量和比例的影響。

[1]楊海燕．母乳中的低聚半乳糖研究和應(yīng)用的最新進(jìn)展[J]．中國食品添加劑,2000(2)：6-9

[2]Bouhnik Y,Flourie B,D′Agay-Abensour L,et al.Administration of transgalactooligosaccharidesincreasesfecalbifidobacteria and modifies colonic fermentation metabolism in healthy humans[J].Journal of Nutrition,1997,127：444-448

[3]張志國．功能性低聚半乳糖的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]．中國食品添加劑,2012(6)：207-213

[4]OSAMU C,RIE T.Effect of β1-4 linked galactooligosaccharides stimulate calcium and magnesium absorption from the large intestine[J].Yakuruto Kenkyusho Kenkyu Hokokushu,1999,19：53-59

[5]張志國．HPLC雙柱法測定低聚半乳糖平均聚合度[J]．中國食品學(xué)報(bào),2013(12)：237-242

[6]PRENOSIL J E,STUKER E,BOURNE J K.Formatiom of oligosaccharides during enzymatic lactose hydrolysis and their importance in a whey hydrolysis process,part II：experimental[J].Biotech Bioeng,1987,30(9)：1026-1031

[7]MIGUEL H,LEIV A L,GUZMAN,et al.Formation of oligosaccharides during enzymatic hydrolysis of milk whey permeates[J].Process Biochem,1995,30(8)：757-762

[8]付文佳,姜淑娟,錢方,等.乳酸克魯維酵母乳糖酶合成低聚半乳糖的研究[J]．食品科技,2016(6)：2-6

[9]李美玲,江波,張濤.β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016(3)：234-239

[10]崔靜．低聚半乳糖的組成及其糖苷鍵異構(gòu)體的分析[C]．西安：第二十屆全國色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會及儀器展覽會論文集,2015：186

[11]李平惠,錢麗麗,楊義杰,等.基于礦物元素指紋圖譜技術(shù)的蕓豆產(chǎn)地溯源研究[J].中國糧油學(xué)報(bào),2016(6)：134-139

[12]莊俊鈺,許佩勤,林丹,等.基于特征氨基酸指紋圖譜的白燕窩識別摻假模型建立與驗(yàn)證[J].食品研究與開發(fā),2016(11)：133-138

Construction of Galactooligosaccharides Fingerprints

ZHANG Zhi-guo
（Tangshan Sanyuan Foods Co.Ltd.，Tangshan 301501，Hebei，China）

Galactooligosaccharides（GOS）fingerprint can be used to provide a method for GOS commercial production technology research，and quality control of GOS production.And it also can provide support for the research of GOS degree.Ion chromatography was be used to study the separation degree and sensitivity of the GOS，then determined the method of constructing GOS fingerprint and mapping commercial GOS fingerprint.By comparison，the separation and sensitivity of ion chromatography were very suitable for mapping the fingerprints of GOS.With ion chromatography，the fingerprint of commercial GOS were drew，and determined the dextrin fingerprint region of GOS.Then the degree of polymerization of GOS was determined preliminarily.Through mapping the fingerprints of GOS，more than 15 kinds of GOS were identified from commercial GOS raw material contains，and there were significant differences between different companies production of GOS.

galactooligosaccharides（GOS）；fingerprints；ion chromatograph（IC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.034

2016-12-21

張志國（1977—），男（漢），高級工程師，碩士，研究方向：食品分析及乳品科學(xué)。