曹順琪，鄭虹，孫超（. 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3009； .天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 3009）

血紅素氧化酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）是血紅素代謝途徑中的限速酶，其本質(zhì)為熱休克蛋白，目前發(fā)現(xiàn)3種類型的HO，即HO-1、HO-2和HO-3，應(yīng)激時(shí)主要由HO-1發(fā)揮作用，可將血紅素分解為鐵離子、膽綠素與一氧化碳等產(chǎn)物，膽綠素隨后轉(zhuǎn)化為膽紅素。HO-1具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)自噬等功能［1］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)HO-1的表達(dá)增加可以減輕肝臟缺血/再灌注損傷及移植后排斥反應(yīng)［2-4］。膽道閉鎖（biliary atresia， BA）是嬰幼兒肝病肝移植的主要適應(yīng)證［5-6］。因此，本研究選取原發(fā)病為BA的患兒作為研究對象，旨在探討B(tài)A患兒血清HO-1表達(dá)水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取天津市第一中心醫(yī)院2015年10月1日-2015年12月31日接受親屬活體供肝移植的BA患兒20例，其中男性8例，女性12例，中位年齡9個(gè)月（7.1～12.8個(gè)月），體重為（8.0±1.2）kg，肝移植術(shù)前兒童終末期肝病模型評分 （pediatric of end-stage liver disease， PELD）中位數(shù)為16分（8～17.8分），肝功能Child-Pugh B級患者14例，C級6例。所有受者均經(jīng)剖腹探查或腹腔鏡探查、膽道造影、葛西（Kasai）手術(shù)及病理檢查明確診斷為BA。

1.2 研究分組：選取20例BA患兒作為實(shí)驗(yàn)組。對照組為5例在天津市婦女兒童保健中心接受體檢的健康兒童，其中位年齡為10個(gè)月，平均體重（10.2±1.9） kg。

1.3 倫理學(xué)：本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，患者臨床資料完整，其法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.4 檢測項(xiàng)目：分別于術(shù)前1周的清晨抽取受者外周靜脈血2 ml，將受者外周血樣本靜置30分鐘，離心后收集上清液，并按1次用量分裝，于-80℃下冷凍保存、待測，避免反復(fù)凍融。同時(shí)記錄檢測患兒直接膽紅素值。

1.5 HO-1的檢測方法：應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清HO-1的表達(dá)水平。將試劑盒中樣本稀釋液與樣本按3：1配比，吸取混合好稀釋樣本 50 μl外加緩沖液 50 μl共 100 μl依次加入酶標(biāo)板孔中，預(yù)留孔加入標(biāo)準(zhǔn)品；將待測樣本于25℃孵育2小時(shí)；反應(yīng)后洗板4次，加入生物素抗體工作液（100 μl/孔），于25℃條件下孵育1小時(shí)；洗板4次，繼續(xù)加入辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase， HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素工作液（100 μl/孔），于25℃下孵育30分鐘；洗板4次，每孔加入100 μl ELISA酶-底物顯色工作液（TMB），避光孵育30分鐘后顯示明顯的梯度藍(lán)，每孔加入100 μl TMB終止液。10分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度值（A值）。根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)品孔對應(yīng)的A值和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線坐標(biāo)得出相應(yīng)的HO-1濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HO-1測定值對比結(jié)果（圖1）：術(shù)前20例BA 患兒的 HO-1為 11 μg/L（9～ 16 μg/L），明顯高于對照組健康兒童的3.7 μg/L （2.6～4.5 μg/L），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝3.196，P＜0.05）。

圖1 各組兒童HO-1測定值的比較

2.2 HO-1與直接膽紅素的關(guān)系（圖2）：20例BA患兒的HO-1測定值與術(shù)前直接膽紅素水平呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)R＝0.576，P＝0.008）。

圖2 術(shù)前直接膽紅素水平與HO-1測定值的相關(guān)性分析

3 討 論

BA導(dǎo)致的終末期肝病是兒童原位肝移植最主要的適應(yīng)證之一。雖然BA患兒可以接受葛西手術(shù)治療，但存在諸多術(shù)后并發(fā)癥［7］，最終仍需接受肝移植治療。HO-1對肝功能起保護(hù)作用。

本研究表明，BA患兒血清HO-1表達(dá)水平高于同齡健康兒童，其原因可能是：① 既往研究中HO-1在生理狀態(tài)下不表達(dá)或低表達(dá)，在缺血、缺氧、高溫、內(nèi)毒素血癥、氧自由基增多、金屬離子過度負(fù)荷等應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1表達(dá)水平明顯升高［8］，膽道梗阻患兒處于高膽紅素血癥、肝硬化的病理狀態(tài)，因此HO-1代償性升高；② 新生兒期肝膽疾病直接膽紅素是具有特異性的敏感指標(biāo)［9］，膽道梗阻狀態(tài)下以直接膽紅素升高為主。且本研究結(jié)果顯示，直接膽紅素與血清HO-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)；③ 有研究結(jié)果顯示，膽道梗阻狀態(tài)下HO-1的表達(dá)量增加，且HO-1隨梗阻時(shí)間延長而升高［10］。

我們同時(shí)對術(shù)前直接膽紅素水平和HO-1測定值進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示BA患兒的HO-1測定值與術(shù)前直接膽紅素水平呈正相關(guān)。HO-1是分解血紅素最終至膽紅素上游代謝的起始酶和限速酶，主要過程為HO-1將血紅素分解為鐵離子、膽綠素與一氧化碳等產(chǎn)物，膽綠素隨后轉(zhuǎn)化為膽紅素。關(guān)鍵酶增多使下游底物增多。Kaplan等［11］研究認(rèn)為，新生兒黃疸導(dǎo)致的高膽紅素升高是由于HO-1基因多態(tài)性導(dǎo)致的。另外，本研究缺乏對移植術(shù)后HO-1表達(dá)水平的檢測，在今后的研究中會(huì)予以補(bǔ)充。Geuken等［12］研究原位肝移植受者肝臟HO-1 mRNA發(fā)現(xiàn)，與供肝HO-1 mRNA初始表達(dá)量高者相比，供肝HO-1 mRNA初始表達(dá)量低的受者術(shù)后更能誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)升高，對肝臟的保護(hù)作用強(qiáng)。Matsumi等［13］對29例活體供肝移植術(shù)后缺血/再灌注損傷的研究發(fā)現(xiàn)，HO-1參與移植物早期的功能恢復(fù)。

目前，對BA乃至兒童肝移植領(lǐng)域HO-1的研究尚不完善，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)作為臨床治療方法的探索較難有進(jìn)展，血清檢測HO-1更是鮮有報(bào)道。BA患兒血清HO-1水平升高與膽道梗阻程度相關(guān)。希望這一結(jié)論能為BA患兒血清HO-1表達(dá)及其應(yīng)用提供新線索。