閆麗華+盧楠楠+和亞男+尹海波+謝先芝

摘要：光敏色素是植物重要的光受體之一，主要感受紅光和遠(yuǎn)紅光。水稻光敏色素基因家族包括3個成員，即PHYA、PHYB 和PHYC。我們已有研究表明PHYB在水稻生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)中具有重要作用。然而目前缺乏有效的水稻PHYB蛋白質(zhì)抗體，極大地制約著PHYB基因作用機(jī)制的解析。在本研究中，我們比較了水稻光敏色素家族3個成員氨基酸序列同源性，選取了PHYB蛋白質(zhì)C端的特異多肽。在此基礎(chǔ)上，分離了特異多肽對應(yīng)的cDNA序列，將其克隆在原核表達(dá)載體pET16b上，利用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)、純化獲得了PHYB蛋白質(zhì)特異性抗原，通過免疫新西蘭大白兔，制備了PHYB蛋白的多克隆抗體。免疫印跡檢測表明該抗體具有很高的特異性。本研究為深入解析PHYB基因在水稻生長發(fā)育中的作用機(jī)制提供了必要保障。

關(guān)鍵詞：水稻；光敏色素；原核表達(dá)；抗體

中圖分類號：S511：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0001-06

Abstract Phytochrome （PHY） is one of the important photoreceptors in plant. Phytochrome family mainly senses red and far-red lights. Rice phytochrome gene family is composed of three members known as PHYA， PHYB， and PHYC. Our previous studies has suggested that PHYB plays important roles in regulating rice growth and development as well as stress responses. However， absence of effective PHYB antibody greatly hinders the dissection of mechanisms of PHYB functions in rice. In this study， we selected the peptide specific to PHYB protein by comparing the amino acid identity among three rice phytochrome members. The cDNA fragment encoding specific PHYB peptide was isolated and cloned into prokaryotic expression vector pET16b. The PHYB antigen was obtained after isopropyl thio-beta-d-galactose（IPTG）induction and purification of expressed protein. The polyclonal PHYB antibody was prepared by immunizing New Zealand rabbits. Western blotting assays revealed that PHYB polycolonal antibody prepared in this study was specific to detect PHYB protein in rice extracts. The results from this study were necessary for comprehensively exploring the functional mechanism of PHYB in rice.

Keywords Rice； Phytochrome； Prokaryotic expression； Antibody

對高等植物而言，光不僅是光合作用的能量來源，也是一種重要的環(huán)境信號因子[1]。高等植物利用光敏色素（phytochromes）、隱花色素（cryptochromes）和向光素（phototropins）等光受體感受其生長環(huán)境中光質(zhì)、光強(qiáng)、光周期等條件的變化，調(diào)節(jié)自身的生長發(fā)育，以最大限度適應(yīng)周圍環(huán)境。其中，光敏色素主要感受紅光（red light，R）和遠(yuǎn)紅光（far-red light，F(xiàn)R）[2]。水稻中光敏色素基因家族包括3個成員：PHYA、PHYB 和PHYC[3-6]。圖位克隆和全基因組檢索顯示，PHYB基因位于水稻的第3染色體短臂，且為單拷貝。Takano等[7]通過伽馬射線誘導(dǎo)突變體篩選得到了多個phyB突變體。通過比較野生型和phyB 突變體的光形態(tài)建成特征，發(fā)現(xiàn)PHYB在水稻生長發(fā)育中具有重要作用，如PHYB可以影響水稻幼苗的去黃化、幼苗主根的伸長和根系的發(fā)育，還影響水稻的花期、育性以及氣孔的形態(tài)和數(shù)目等特征[8-10]。近幾年，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，水稻phyB突變體具有較強(qiáng)的耐旱性和耐低溫能力[11，12]，因此phyB突變體可以作為重要的種質(zhì)資源用于水稻早熟、耐逆品種的培育。

然而，關(guān)于PHYB在水稻生長發(fā)育中的作用機(jī)制研究還有待深入。蛋白質(zhì)印記技術(shù) （Western Blot）可以利用抗原和抗體特異性結(jié)合來定性定量檢測復(fù)雜樣品中特定目的蛋白，具有靈敏度高、特異性好、操作簡便和結(jié)果直觀等優(yōu)點。因此PHYB蛋白特異抗體的制備對解析PHYB基因的作用機(jī)制具有重要作用。然而，目前還沒有有效的商業(yè)化水稻PHYB蛋白質(zhì)抗體可以使用。本研究擬探索PHYB抗體的制備方法，并對其特異性進(jìn)行檢測，以期為深入解析PHYB基因在水稻生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料endprint

本研究所用水稻材料是日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）、phyB突變體（phyB-1，其遺傳背景的詳細(xì)描述參考Takano等[7]的報道）。pET16b表達(dá)載體，購自Novagen 公司（其中包含廣泛使用的IPTG誘導(dǎo)的啟動子tac，用于親和純化融合的標(biāo)簽His-Tag）；克隆宿主菌為E. coli DH5α，表達(dá)宿主菌為E. coli BL21（DE3），均購于全式金公司。免疫動物為購買的新西蘭大白兔。

1.2 PHYB特異cDNA片段擴(kuò)增

采用TRIZOL試劑（Invitrogen）提取日本晴葉片總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度。按反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript Ⅱ（Invitrogen）說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以合成的第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。

通過比較水稻光敏色素家族蛋白的同源性，選取PHYB 蛋白質(zhì)C端特異的多肽序列，根據(jù)其對應(yīng)的cDNA，設(shè)計上游引物phyBhisF：5′-AACCATGGGCCCAGATGCATTAACGAAATTC-3′和下游引物phyBhisR：5′-ATCCATGGTGCTTGTCCCCCTACTTG-3′（下劃線部分序列為NcoⅠ位點）。利用PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer（TaKaRa）擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×PrimeSTARTMGC Buffer（TaKaRa）25 μL、dNTP Mixture 4 μL、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase 0.5 μL、cDNA模板200 ng、0.2 μmol/L基因特異性引物對。PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1 min；然后98℃ 10 s，68℃ 1 min，30個循環(huán)。PCR完畢后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 PHYB特異cDNA片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將得到的PHYB特異cDNA片段PCR產(chǎn)物用NcoⅠ單酶切，回收插入片段；用同樣的方法單酶切pET16b（Amp抗性）原核表達(dá)載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段在4℃環(huán)境連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5α，篩選陽性克隆并測序，挑取序列正確的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，得到重組載體，命名為pET16b-PHYB。將構(gòu)建的重組載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E. coli BL21（DE3）。

1.4 PHYB重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和初步純化

1.4.1 重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)及電泳檢測 挑取含重組質(zhì)粒pET16b-PHYB的菌體單斑至2 mL LB液體培養(yǎng)基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃過夜培養(yǎng)。次日按1∶100比例稀釋過夜菌，取50 μL菌加入到5 mL LB培養(yǎng)基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h （OD600≈0.6）。取部分菌液作為未誘導(dǎo)的對照組（0 h），余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1 mmol/L作為試驗組，分三組37℃、200 r/min分別繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2、4、6 h。

分別取菌液1 mL，12 000×g離心30 s收獲沉淀，用50 μL的5×凝膠電泳上樣緩沖液重懸，混勻，100℃煮沸10 min，冰上放置2 min， 12 000×g離心10 min，取上清作為樣品，利用12% SDS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色檢測。

1.4.2 重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化 挑取含重組質(zhì)粒pET16b-PHYB的菌體單斑至2 mL LB液體培養(yǎng)基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃過夜培養(yǎng)。次日按1∶100比例稀釋過夜菌，取200 μL菌加入到20 mL LB培養(yǎng)基（含Carb 100 μg/mL）中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h （OD600≈0.6）。加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1 mmol/L，繼續(xù)37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。

取全部菌液，7 000 r/min離心20 min，4℃收獲沉淀。用5 mL懸浮液（1×TE+1 mol/L NaCl+1% Triton X-100）懸浮沉淀。使用超聲波破碎儀（SONICS VCX 150）破碎菌體，具體為將用緩沖液洗滌過的超聲探頭伸入到菌液中，不要接觸燒杯底部，每處理10 s，間隔10 s使菌液冷卻，破碎10 min，輸出振幅設(shè)為30%。在冰上放置 30 min 后，15 000 r/min離心5 min，4℃收獲沉淀 （保存上清液1號）。繼續(xù)向沉淀加入5 mL懸浮液，如上超聲破碎并冰浴，離心收集沉淀，這樣重復(fù)6次，保存第6次上清（上清液6號），收集第6次沉淀，最后一次沉淀用1 mL 1×TE buffer 懸浮。取20 μL重新溶解的沉淀，加5 μL 5×凝膠電泳上樣緩沖液，同時用上清液1號和上清液6號作為對照，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測。

1.5 多克隆抗體血清的制備

免疫動物選擇三個月左右、體重2 kg以上的健康新西蘭大白兔，用已制備的PHYB重組蛋白作為抗原免疫動物。具體為將PHYB原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，用預(yù)冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取含有目的蛋白的膠條，按1∶1比例（W/V）加入0.9%生理鹽水在預(yù)冷的研缽中研磨。將獲得的目的蛋白加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化后，對兔子進(jìn)行四肢、腋下及背部皮下多點注射，首次免疫兩周后進(jìn)行第二次免疫，以后每間隔兩周加強(qiáng)一次（共進(jìn)行四次免疫）。第三次免疫12 d后，經(jīng)耳靜脈取血測定抗體效價。達(dá)到要求者于第四次免疫11 d后頸動脈放血，收集血樣。將血樣靜置于4℃過夜，在4℃條件下，5 000 r/min離心10 min，收集血清，分裝后-80℃保存。endprint

1.6 PHYB多克隆抗體特異性鑒定

日本晴及phyB突變體水稻種子表面消毒后，播種于0.4%（W/V）的瓊脂培養(yǎng)基中，在28℃黑暗培養(yǎng)箱生長7 d后，分別取日本晴和突變體水稻的地上部分，在液氮中速凍，然后通過蛋白提取液（100 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5；5 mmol/L EDTA，pH值8.0；0.2%巰基乙醇；100 mmol/L PMSF）提取蛋白，利用硫酸銨鹽析除去大部分雜蛋白，冰上放置30 min，15 000 r/min離心30 min，用1/10體積的蛋白提取緩沖液溶解沉淀，從而得到初步分離純化的蛋白質(zhì)，然后用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。配制10%分離膠、5%濃縮膠，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳上樣量為50 ng蛋白，加入5×凝膠上樣緩沖液至終濃度為1×。沸水中煮5 min使蛋白變性，加足夠電泳液后準(zhǔn)備上樣，電泳時間1～2 h，先用80 V電壓，當(dāng)觀察到溴酚藍(lán)位于濃縮膠和分離膠交界處時，將電壓調(diào)至120 V，直至溴酚藍(lán)跑到膠的最底端。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST（1 mol/L Tris-HCl，pH值7.5；0.5 mol/L NaCl；0.1% Tween 20）配制5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h。加入制備的PHYB抗體（以3∶10 000進(jìn)行稀釋）作為一抗，與PVDF膜孵育后，進(jìn)行洗膜，然后以1∶10 000稀釋的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG為第二抗體，經(jīng)過底物避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHYB特異cDNA片段的克隆

我們比較了水稻光敏色素家族3個成員氨基酸序列同源性，發(fā)現(xiàn)其C端同源性較低（圖1），故選取PHYB蛋白質(zhì)C端特異多肽對應(yīng)的cDNA序列設(shè)計引物。利用設(shè)計的特異引物，以野生型水稻日本晴葉片cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR獲得PHYB特異cDNA序列，約1 000 bp（圖2）。將該片段克隆至pET16b載體上，測序結(jié)果顯示，該片段長951 bp，如圖3A所示。利用NCBI ORF finder軟件預(yù)測其氨基酸序列，該特異序列編碼317個氨基酸，分子量大小為36 kD（圖3B）。

2.2 PHYB重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化

以1∶100比例稀釋重組質(zhì)粒菌體單斑的過夜菌繼續(xù)培養(yǎng)3 h為最佳誘導(dǎo)開始時間，通過IPTG誘導(dǎo)劑分別小量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白0、2、4、6 h，經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖4A），在分子量36 kD處有明顯條帶，與預(yù)期PHYB重組蛋白分子量大小一致。經(jīng)過大量擴(kuò)繁、誘導(dǎo)收集（選擇誘導(dǎo)時間為4 h）、六次超聲破碎重懸蛋白菌體后獲得第1次上清、第6次上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析（圖4B）顯示，PHYB重組蛋白只出現(xiàn)在沉淀中，上清中沒有，說明PHYB重組蛋白形成了包涵體。

2.3 PHYB多克隆抗體的特異性檢驗

利用獲得的PHYB多克隆抗體對日本晴及phyB突變體進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗，我們預(yù)測PHYB蛋白質(zhì)的分子量大約107 kD，由圖5可見，在日本晴蛋白提取物上樣的泳道中出現(xiàn)一條分子量約100 kD的蛋白帶，與預(yù)測的PHYB蛋白質(zhì)基本一致，而phyB突變體上樣的泳道中沒有出現(xiàn)，說明制備的PHYB多克隆抗體與野生型中的PHYB蛋白有特異性免疫反應(yīng)，具有非常好的特異性。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，我們比較了水稻光敏色素家族3個成員氨基酸序列同源性，選取了PHYB蛋白質(zhì)C端特異多肽。首次通過在原核細(xì)菌中表達(dá)PHYB的C端多肽作為抗原，通過免疫兔子制備了特異性的PHYB蛋白質(zhì)的多克隆抗體，通過樣品檢測證明了抗體的適用性，且該抗體具有很高的特異性。為深入解析PHYB基因在水稻生長發(fā)育中的作用機(jī)制提供了必要保障。

本研究制備的多克隆抗體特異性好，可與水稻光敏色素蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，且制備成本低，得率高，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。該抗體可對水稻不同生長條件下、不同發(fā)育時期的光敏色素蛋白質(zhì)的表達(dá)情況進(jìn)行分析研究，也可用于免疫共沉淀技術(shù)以分析PHYB蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間的相互作用。但是該抗體免疫雜交結(jié)果顯示有背景雜帶，這對于那些對抗體特異性要求特別高的試驗是不合適的，如染色體免疫共沉淀試驗。對于這類試驗，我們需要進(jìn)一步純化抗體。

參考文獻(xiàn)：

[1]戰(zhàn)吉宬， 黃衛(wèi)東， 王利軍. 植物弱光逆境生理研究綜述[J]. 植物學(xué)報， 2003， 20（1）：43-50.

[2]顧建偉， 劉婧， 薛彥久，等. 光敏色素在水稻生長發(fā)育中的作用[J]. 中國水稻科學(xué)， 2011， 25（2）：130-135.

[3]Kay S A， Chua N H. The rice phytochrome gene： structure， autoregulated expression， and binding of GT-1 to a conserved site in the 5′ upstream region[J]. The Plant Cell， 1989， 1（3）：351.

[4]Dehesh K， Tepperman J， Christensen A H， et al. phyB is evolutionarily conserved and constitutively expressed in rice seedling shoots[J]. Molecular Genetics and Genomics， 1991， 225（2）：305-313.

[5]Basu D， Dehesh K， Schneider-Poetsch H J， et al. Rice PHYC gene： structure， expression， map position and evolution[J]. Plant Molecular Biology， 2000， 44（1）：27-42.endprint

[6]Tahir M，Kanegae H，Takano M. Phytochrome C （PHYC） gene in rice： isolation and characterization of a complete coding sequence[J]. Plant Physiology，1998，118： 1535.

[7]Takano M， Inagaki N， Xie X， et al. Distinct and cooperative functions of phytochromes A， B， and C in the control of deetiolation and flowering in rice[J]. The Plant Cell， 2005，17（12）：3311-3325.

[8]Takano M，Kanegae H，Shinomura T，et al. Isolation and characterization of rice phytochrome A mutants[J]. The Plant Cell，2001，13： 521-534.

[9]Xie X， Shinomura T， Inagaki N， et al. Phytochrome-mediated inhibition of coleoptile growth in rice： age-dependency and action spectra [J]. Photochemistry & Photobiology， 2007， 83（1）：131-138.

[10]Takano M， Inagaki N， Xie X， et al. Phytochromes are the sole photoreceptors for perceiving red/far-red light in rice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106（34）：14705-14710.

[11]Liu J， Zhang F， Zhou J J， et al. Phytochrome B control of total leaf area and stomatal density affects drought tolerance in rice [J]. Plant Molecular Biology， 2012， 78： 289-300.

[12]周晉軍， 劉蓬， 尹靜靜，等. 脯氨酸代謝途徑在調(diào)控水稻phyB突變體干旱脅迫耐性中的作用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014（3）：1-4.endprint