● 郭迎科 李瑞琴

紅花黃色素對TGF-β1誘導的人肺泡上皮A549細胞轉分化的抑制作用及其信號轉導機制研究※

● 郭迎科 李瑞琴▲

目的：通過體外培養(yǎng)人肺泡上皮細胞A549，用TGF-β1刺激其發(fā)生上皮-間質轉化，運用現(xiàn)代分子生物學和超微病理學實驗技術，探討紅花黃色素在防治肺間質纖維化上皮間質轉化中的干預作用及機制。方法：將正常培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞A549分6組：正常對照組、TGF-β1誘導組(TGF-β1終濃度為5ng/ml，誘導24h)、地塞米松組(地塞米松2μg/mL)、紅花黃色素低、中、高3個劑量干預組(紅花黃色素25μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素中劑量組紅花黃色素50μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素高劑量組紅花黃色素75μg/mL+TGF-β1 5ng/mL)。TGF-β1 5ng/L干預A549細胞生長24h，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)檢測不同劑量紅花黃色素作用于TGF-β1刺激A549細胞后其發(fā)生上皮-間質轉化后各組的吸光值(OD值)，計算其增殖活性，繪制細胞增殖曲線。采用倒置顯微鏡觀察各組細胞的生長狀態(tài)與形態(tài)變化。結果：(1)MTT檢測結果顯示：與正常對照組相比較，TGF-β1誘導組細胞活力略高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；紅花黃色素中藥干預組細胞的增殖活力下降，與正常對照組和TGF-β1誘導組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)倒置顯微鏡觀察顯示：經(jīng)過TGF-β1刺激后，A549細胞由正常的鋪路石樣貼壁生長呈現(xiàn)出間質細胞的特征，呈明顯的拉長狀態(tài)，由鵝卵石狀轉變?yōu)榧忓N型或梭型，出現(xiàn)偽足樣改變，藤索樣生長，類似于成纖維細胞，且細胞之間間隙增大。結論：通過觀察紅花黃色素各劑量組發(fā)現(xiàn)，細胞的形態(tài)逐漸接近正常的A549細胞，視野內(nèi)細胞的數(shù)目按一定的劑量效應關系減少。

肺纖維化 紅花黃色素 上皮-間質轉分化

肺纖維化又稱肺間質纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)，是以彌漫性肺泡炎、肺間質炎癥和間質纖維化為特征的病變。隨著近年來汽車尾氣、工廠廢氣和工地的揚塵等增多，大氣污染加劇，霧霾頻發(fā)，肺纖維化發(fā)病率持續(xù)攀升[1]。中醫(yī)中藥在治療肺纖維化方面具有獨特的優(yōu)勢。本實驗運用現(xiàn)代分子生物學實驗技術，探討紅花黃色素對TGF-β1誘導的人肺泡上皮A549細胞轉分化的抑制作用及其信號轉導機制研究，為臨床應用紅花黃色素治療肺纖維化提供實驗室依據(jù)。

1 材料

1.1細胞株人肺泡上皮細胞A549(凱基生物公司)

1.2主要藥物與試劑人重組TGF-β1(美國PEPROTECH公司)；重組細胞因子溶解液稀釋套裝(聯(lián)科生物)紅花黃色素(山西德元堂藥業(yè)有限公司，批號H41020330)；地塞米松磷酸鈉注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，批號1607206)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，批號H37022750)RPMI 1640培養(yǎng)基(Solarbio生物公司)；青、鏈霉素混合液(Solarbio生物公司)；胎牛血清(杭州四季青)；四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶(Solarbio生物公司)；二甲基亞砜(DMSO，Solarbio生物公司)。

1.3儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(北京世安公司)；全自動高壓蒸汽滅菌器(日本TOMY公司)；超低溫冰箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；細胞培養(yǎng)瓶、96孔細胞培養(yǎng)板(上海圣納堡生物公司)；超低溫冰箱(美國Thermo公司)；純水機(美國密理博公司)；制冰機(常熟雪科公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；臺式離心機(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)[2-3]

2.1.1 細胞復蘇 將人肺泡上皮細胞A549從-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴鍋，一次性手套包裹輕輕搖晃使細胞凍存塊快速充分溶化；消毒凍存管管口四周后開啟，將溶解好的細胞懸液吸入10mL離心管中，加入雙倍體積的10%1640完全培養(yǎng)基，800r/min低速離心5min；去除凍存液，PBS洗滌細胞1～2遍；10%完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液按照預先設定好的實驗步驟接種到新的培養(yǎng)瓶中；標記后入37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱。

2.1.2 細胞培養(yǎng)與傳代 細胞培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)，待細胞長滿約80%時進行細胞傳代；棄舊的培養(yǎng)基，PBS洗滌一次細胞，去除多余的培養(yǎng)基；加入適量的0.25%的胰酶消化，消化時間根據(jù)鏡下觀察的細胞形態(tài)(變小變圓，即將開始脫落)來控制，終止消化時加入完全培養(yǎng)基進行終止；收集細胞至15mL離心管，離心、洗滌細胞1～2次后制成單細胞懸液；將單細胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶里；標記細胞與實驗者信息，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.1.3 細胞凍存 取指數(shù)生長期A549細胞，消化、離心，棄上清，制成1×106個/mL的單細胞懸液，加入凍存液1mL(RPMI1640：FBS：DMSO=7∶2∶1)；放入細胞凍存管并標記、封口，依次于4℃冰箱放置60分鐘，-20℃冰箱放置120分鐘，最后放入-80℃冰箱保存。

2.2造模及分組根據(jù)MTT預實驗結果及實驗的綜合考慮，選取紅花黃色素75μg/mL、50μg/mL及25μg/mL的濃度梯度來進行實驗，選取地塞米松2μg/mL，該實驗分為6組：正常對照組、TGF-β1誘導組(TGF-β1終濃度為5ng/ml，誘導24h)、地塞米松組(地塞米松2μg/mL)、紅花黃色素低、中、高3個濃度干預組(紅花黃色素高濃度組75μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素中濃度組紅花黃色素50μg/mL+TGF-β1 5ng/mL、紅花黃色素低濃度組 25μg/mL+TGF-β1 5ng/mL)。先用5ng/mL TGF-β1刺激A549細胞24h，然后加入地塞米松及各濃度的紅花黃色素；正常對照組則為10%1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞。

2.3細胞增殖檢測收集細胞取正處于對數(shù)生長期的細胞，加胰酶消化，離心后用10%的1640完全培養(yǎng)基制成含2.5×104個/mL的單細胞懸液。接種96孔板根據(jù)預實驗結果選取的紅花黃色素3個濃度，每個計量組設6個復孔，4個時間點，每個時間點設3個復板；在96孔板上加入所制成的細胞懸液，每孔200μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待細胞貼壁；吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的藥物和正常對照組的完全培養(yǎng)基200μL，培養(yǎng)箱里繼續(xù)培養(yǎng)；分別于12h、24h、48h取出細胞培養(yǎng)板，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h；棄上清，加150μL DMSO/孔，搖床震動約20min，充分溶解沉淀；酶聯(lián)免疫檢測儀測定，設定波長為490nm，測出各組的吸光度(OD值)，實驗重復5次[4-5]；以各時間點為橫坐標，各組細胞相應的OD值為縱坐標，繪制A549細胞的生長曲線圖。

2.4細胞形態(tài)檢測培養(yǎng)細胞，設置正常對照組、TGF-β1模型誘導組、地塞米松組和紅花黃色素高、中、低濃度干預組，倒置顯微鏡下觀察并拍照細胞在不同的時間點的狀態(tài)表現(xiàn)并拍照保存，取生長24h的細胞圖片(放大100倍)，對比各組細胞的變化及不同。

3 結果

3.1倒置顯微鏡觀察結果倒置相差顯微鏡下，采用TGF-β1 5ng/mL干預A549細胞生長24h后，細胞出現(xiàn)顯著變化。正常的A549細胞多呈鋪路石樣上皮細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，TGF-β1刺激后，細胞形態(tài)變?yōu)榧忓N形或梭形，出現(xiàn)偽足樣改變，呈現(xiàn)拉長狀態(tài)，細胞之間間隙加大，藤索樣生長，連接變得稀疏，類似于成纖維細胞。紅花黃色素干預后A549細胞形態(tài)逐漸趨于正常。見圖1。

a.正常對照組 b.TGF-β1模型誘導組 c.地塞米松組

d.紅花黃色素高濃度組 e.紅花黃色素中濃度組 f.紅花黃色素低濃度組

圖1倒置顯微鏡觀察結果

3.2 MTT檢測結果MTT法中測得的實驗各組的吸光值，計算出不同濃度的紅花黃色素對細胞的增殖的作用。結果顯示：TGF-β1 5ng/mL誘導A549細胞，細胞的增殖活性略有增加，與正常對照組細胞比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；紅花黃色素干預細胞后，在一定的藥物劑量范圍內(nèi)，隨藥物劑量的增加，細胞的增殖受到影響。各組間進行比較，12h、24h及48h時，紅花黃色素三個濃度組與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與TGF-β1誘導組比較，12h、24h時紅花黃色素三個濃度組均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，48h時僅低濃度組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 紅花黃色素對A549體外增殖的影響(n=5；；吸光值A490nm)

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與TGF-β1誘導組比較，*P<0.05。

圖2 紅花黃色素對A549體外增殖的影響

4 討論

肺纖維化是一個不可逆的漸進性疾病，是多種肺部疾病的終末表現(xiàn)，目前缺乏有效的治療手段和治療藥物。隨著科學技術的不斷發(fā)展與進步，肺纖維化發(fā)生機制的分子層次研究方興未艾，單味或復方中藥對不同通路的多靶點的協(xié)同治療將成為中醫(yī)藥防治肺纖維化的新趨勢[1]。

上皮間質轉化是指有極性的上皮細胞失去其上皮特征并逐漸轉化為具有遷徙和侵襲能力的間充質細胞的過程。在致病因素的長期作用下，肺泡上皮細胞的完整性和特征被打亂并重排，引起形態(tài)學或生理學上的改變，部分上皮細胞表型發(fā)生改變，發(fā)生上皮細胞-間質細胞轉分化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT過程有多條信號通路參與，各條信號通路之間通過配體相互交聯(lián)，使EMT過程在一定程度上維持穩(wěn)態(tài)。

轉化生長因子-β(TGF-β)是一種多效性的細胞因子，是目前肺纖維化的研究熱點和重要的藥物作用靶點。TGF-β可由淋巴細胞、單核細胞、上皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生，通過自分泌和旁分泌的方式調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移、黏附，調節(jié)細胞外基質(Extracellular matrixc，ECM)的代謝，參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷和修復。大量的實驗研究表明，TGF-β在小鼠肺纖維化疾病的過程中起著關鍵的作用如調節(jié)膠原蛋白合成、成纖維細胞增生、細胞凋亡、以及成纖維細胞分化[6]。

研究[7]表明，其致纖維化作用不僅與下游Smad蛋白家族信號通路有關，還與絲裂原活化蛋白激酶家族ERK1/2信號通路密切相關，兩者共同調控相應的靶分子轉錄。有研究顯示，博萊霉素(BLM)誘導大鼠肺纖維化模型中肺組織各時間段ERK1、ERK2、磷酸化ERK1/2的表達明顯高于同期對照組，說明信號蛋白ERK1/2在肺泡炎癥和纖維化階段均參與了BLM致肺纖維化的發(fā)病過程[8]。國內(nèi)外研究表明，在博來霉素、二氧化硅、石棉和電離輻射致肺纖維化的人和動物模型中均有磷酸化的ERK(p-ERK)表達增加，再次證明ERK信號通路在一定程度上參與了纖維化病變的發(fā)生[9]。由此可見，ERK信號通路可能是TGF-β1對細胞調控作用中最為重要的通路之一。Davis等[10]與Mucsi等[11]均在各自研究中發(fā)現(xiàn)，給細胞轉染顯性失活的ERK，可抑制TGF-β1刺激的纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)和I型膠原(COL-I)增強子等的活性；而轉染相應的野生型ERK質粒卻引起膠原基因的表達增加。TGF-β介導的ERK通路是肺纖維化形成最為重要的通路之一。研究發(fā)現(xiàn)[12]，TGF-β受體I(TβRI)主要介導TGF-β1的促纖維化作用，TGF-β受體II(TβRⅡ)則主要參與抑制細胞生長。組織纖溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)是重要的ECM成分。活化后的絲裂原活化蛋白激酶(motogen-activated protein kinases，MAPKs)轉位到細胞核，激活轉錄因子，調節(jié)相應效應基因而發(fā)揮作用。研究顯示[13]，ERK磷酸化(p-ERK)蛋白水平明顯上調，ERK蛋白表達水平無大變化，TβRI可經(jīng)Ras/ERK通路促進膠原合成，印證了ERK依賴的受體活化型Smad(R-Smad)接頭域的磷酸化作用增強了I型膠原合成，提示ERK和Smads信號之間在膠原產(chǎn)生上存在著協(xié)同作用。

TGF-β誘導的EMT在肺纖維化的形成過程中扮演非常重要的角色，EMT的分子機制及逆轉EMT的分子機制目前尚不是很明確，進一步研究影響上皮間質轉化這一病理生理現(xiàn)象的調控因素及其在肺纖維化中的作用及相關信號通路，是目前肺纖維化的靶向藥物研究和治療思路。

紅花黃色素(Saffower Yellower)是菊科植物紅花[14]的干燥花的主要生理活性成分，具有擴張周圍血管、降低血壓、抑制血小板聚集、增強纖維蛋白溶解、降低全血黏度等作用。紅花活血通經(jīng)，祛瘀止痛，在臨床上主要用于治療閉塞性腦血管疾病、冠心病、脈管炎。近年來，關于紅花黃色素的抗纖維化作用引起了人們的關注，并進行了許多體內(nèi)外實驗[2]。研究[3]已發(fā)現(xiàn): 紅花黃色素可緩解大鼠和小鼠急性肺部炎癥損傷所致的水腫、淤血及炎癥因子表達的升高，紅花黃色素能緩解大鼠慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中的炎癥損傷；以紅花黃色素為主要成分的紅花注射液能緩解博來霉素誘導的大鼠肺纖維化以及紅花黃色素可抑制 TGF-β1誘導人肺泡上皮細胞A549活化。

本研究表明TGF-β1能刺激人肺泡上皮細胞向間質細胞發(fā)生轉變，紅花黃色素作用后12h、24h及48h三個濃度組與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A549細胞形態(tài)逐漸趨向于正常。與TGF-β1誘導組比較，12h、24h時紅花黃色素三個濃度組均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而48h時僅低濃度組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由此可見紅花黃色素能抑制TGF-β1誘導的人肺泡上皮細胞A549發(fā)生向間質細胞轉變的趨勢。其調控因素及在肺纖維化中的作用機制及相關信號通路的研究，是我們下一步探索的方向。

[1]郭迎科，李瑞琴，丁玉文.肺纖維化發(fā)病機制的細胞因子研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥雜志.2016，12(19)：69-71.

[2]賽利斯.細胞和組織培養(yǎng)相關技術、病毒、抗體、免疫細胞化學-細胞生物學實驗手冊[M].北京：科學出版社，2008：42-182.

[3]蘭 容，周珍輝.動物細胞培養(yǎng)基本技術方法[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：14-95.

[4]劉建文.細胞培養(yǎng)技術在藥理學研究中的應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：56-120.

[5]向 麗，朱 江，曾 靜.細菌藥敏試驗MTT法與常量稀釋法比較性研究[J].瀘州醫(yī)學院學報，2006，29(1)：45-46.

[6]董曉峰，趙 靜，王獻華，等.轉化生長因子β1相關基因在肺纖維化中的作用[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39(6)：1548.

[7]KamarajuAK，Roberts A B.Role of Rho/ROCK and p38MAP kinase pathways in transforming growth factor-beta-mediated Smad-dependent growth inhibition of human breast carcinoma cells in vivo[J].J Biol Chem，2005，280(2)：1024-36.

[8]徐 芳，徐啟勇，葉燕青. ERK信號通路在肺纖維化大鼠中的研究[J].武漢大學學報(醫(yī)學版)，2005，26(3)：322-5.

[9]趙明哲，劉靖華，李玉花，等.ERK信號通路的信號轉導調控機制[J].國際病理科學與臨床雜志，2009，29(1)：15-19.

[10]DavisB H，Chen A，Beno D A.Raf and mitogen-activated protein kinase regulate stellate cell collagen gene expression[J].J Biol Chem，1996，271：11039-42.

[11]Mucsi I，SkoreckiK L，GoldbergH J.Extracellular signa-l regulated kinase and the small GTP-binding protein，rac，contribute to the effects of transforming growth factor-B1on gene expression[J].J BiolChem，1996，271：16567-72.

[4]楊雅茹，黃 艷，李 俊.TGF-βl介導的Smads與ERK通路在肺纖維化中的作用及相互關系[J].中國藥理學通報，2010，26(5)： 561-563.

[13]TaoYY，Wang X L，LiuCH. Salvianolic acid-B effects on TGF-βl/ERK signaling transducfion in NIH/3T3 fibroblast[J].J Cap Med Univ，2007，28(2)：192-195.

[14]高學敏.中藥學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006.

2017年度河南省高等學校重點科研項目(No.17A310020)；河南省科技廳基礎與前沿技術研究(No.112300410052)；河南省高等學校重點科研項目(No.17A310020)；河南中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新項目(No.2016YCX004)

李瑞琴，女，教授，碩士生導師。主要從事中醫(yī)藥防治肺纖維化。E-mail:xyzjane1314@163.com

河南中醫(yī)藥大學(450046)

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