蔣陳凱，趙文芳，黃亞輝，曾 貞，吳春蘭，賴幸菲，袁思思

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

大瑤山野生茶樹的生化特性研究

蔣陳凱，趙文芳，黃亞輝*，曾 貞，吳春蘭，賴幸菲，袁思思

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

為探究大瑤山山脈野生茶樹資源的生化成分特征，本研究測定了來自大瑤山29份茶樹單株的19項(xiàng)生化指標(biāo)。其中用分光光度法檢測茶多酚、游離氨基酸、黃酮等含量，用高效液相色譜檢測兒茶素、生物堿等組成，用氨基酸分析儀檢測氨基酸組成。對(duì)主要生化成分進(jìn)行遺傳多樣性分析和聚類分析，結(jié)果表明大瑤山野生茶具有豐富的遺傳多樣性和地域獨(dú)特性，并從中篩選出了一批特異資源，如高氨基酸(>4.00%)資源9份、高咖啡堿(>5.00%)資源23份、高EGCG(>10%)3份。

大瑤山野生茶樹；生化特性；聚類分析

茶是當(dāng)今世界“三大飲料”之一。中國是世界上最早栽培茶樹、利用茶葉的國家。中國的廣西與云南、貴州毗鄰的地區(qū)為茶樹的次生起源中心之一，且由于廣西橫跨西南和華南兩個(gè)茶區(qū)，特有的地理生態(tài)環(huán)境形成了十分豐富的野生茶樹種質(zhì)資源。大瑤山形成于古生代晚期的二疊紀(jì)，位于廣西中部，山脈為東北-西南走向，是重要的生態(tài)屏障，平均海拔1200 m[1, 2]。地質(zhì)古老獨(dú)特，氣候溫和，雨量充足，適合茶樹的生長。野生茶樹是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)茶組(Sect.Thea)植物野生種類的總稱[3]。大瑤山得天獨(dú)厚的環(huán)境孕育了大量的野生茶樹，其野生茶樹資源具有重要的開發(fā)價(jià)值。生化成分的多樣性是DNA遺傳多樣性的表現(xiàn)形式[4]。茶葉中對(duì)機(jī)體健康有重要作用的生化成分如茶多酚、氨基酸、咖啡堿等多為茶樹的次級(jí)代謝產(chǎn)物，且與茶樹的抗性和對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)有關(guān)[5]。因此，采用生化成分鑒定是研究、開發(fā)、利用野生茶資源的重要參考依據(jù)。

目前野生茶樹種質(zhì)資源的研究大多集中于云南、貴州一帶[6-7]，較少有對(duì)廣西野生茶樹資源的報(bào)道[8-10]。本文對(duì)廣西大瑤山野生茶樹資源的生化成分特征展開系統(tǒng)研究，并據(jù)此選出優(yōu)良單株、特異野生茶資源，如高咖啡堿、高氨基酸、高EGCG等資源，旨在推動(dòng)野生茶樹資源的開發(fā)利用，促進(jìn)茶樹育種的科學(xué)研究、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)茶葉的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 DYS1～DYS13取自六巷上古陳屯，DYS14～DYS23取自羅運(yùn)白牛屯，DYS24～DYS29取自共和坤林屯。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品、可可堿標(biāo)準(zhǔn)品、茶葉堿標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素單體(GC、C、EGC、EGCG、EC、GCG、ECG、CG)標(biāo)準(zhǔn)品、游離氨基酸單體標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC，Sigma-Aldrich Co. LLC)；甲醇(HPLC，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；碳酸鈉、甲醇、福林酚(Fnlin-Ciocalteu)試劑、沒食子酸、草酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、茚三酮、氯化亞錫、碳酸氫鈉、三氟乙酸、三氯化鋁、磷酸緩沖液(AR，廣州光華化學(xué)有限公司)。

1.2 主要儀器設(shè)備

AB204-N型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；DHG-101電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；DK-8D電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；高效液相色譜儀Agilent 1200(美國Agilent公司)；氨基酸分析儀(日立L-8800型)。

1.3 樣品前處理

參考《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》的方法[11]，采摘鮮葉(春季第1輪新梢的一芽二葉)→微波爐殺青→烘干→備用。

1.4 茶葉生化成分測定

水分含量的測定參照GB/T 8304-2013恒重法測定；水浸出物含量的測定參照GB/T 8305-2013全量法測定；茶多酚總量的測定參照GB/T 8313-2008酒石酸亞鐵法測定；游離氨基酸總量的測定參照GB/T 8314-2013茚三酮比色法測定[12]。

生物堿和兒茶素單體采用高效液相色譜法測定。色譜條件色譜柱HyPersil ODS2(4.6 mm × 250 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司)，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相A為甲醇，B為0.5‰三氟乙酸水溶液，流速0.8 mL·min-1，檢測波長278 nm，洗脫梯度(流動(dòng)相A的變化)：0～2 min，2% A；2～8 min，A升至8%；8～30 min，A升至10%；30～35 min，A升至20%；35～45 min，A升至25%；45～50 min，A升至30%，并保持5 min；55～60 min，A升至35%。

游離氨基酸單體采用氨基酸分析儀測定，檢測依據(jù)：JY/T019-1996氨基酸分析方法通則，檢測條件：柱溫為程序變溫，色譜柱為日立855-350型，柱溫為134℃，時(shí)間為110 min，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸濃度100 μmol·L-1，進(jìn)樣量20 μL，溫度26℃，相對(duì)濕度74%。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

各生化成分的最小值、最大值、平均值，Shannon-wiener指數(shù)(H′)用Excel2013計(jì)算。計(jì)算H′前先對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行質(zhì)量化處理，以每個(gè)性狀極差的1/10為間距將各性狀分為10個(gè)等級(jí)，H′=-ΣpilnPi式中：Pi=Ni/N(Pi某性狀第i個(gè)代碼出現(xiàn)的頻率，Ni某性狀第i個(gè)代碼出現(xiàn)的個(gè)數(shù)，N某性狀所有代碼出現(xiàn)的個(gè)數(shù))。

在做聚類分析前，為同等地對(duì)待每個(gè)變量，消除數(shù)據(jù)數(shù)量級(jí)的影響，先對(duì)數(shù)據(jù)做標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后計(jì)算歐氏距離，計(jì)算公式為：

其中，p為變量個(gè)數(shù)，i、j為樣本序號(hào)，然后用ward法進(jìn)行聚類分析，其原理為同類樣本之間的離差和應(yīng)當(dāng)較小，不同類樣本間的離差和應(yīng)當(dāng)較大(采用軟件R3.1.1處理)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大瑤山野生茶樹資源遺傳多樣性分析

H′值愈大，群落所含的信息量愈大，當(dāng)H′>3.0時(shí)，表明物種豐富。根據(jù)表1可知，大瑤山野生茶樹主要生化成分水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、黃酮類、生物堿5類基本生化成分的H′均高于3.0，表明大瑤山野生茶具有豐富的遺傳多樣性。遺傳多樣性最大的是生物堿，達(dá)3.85。兒茶素組成和比例指示著茶樹的進(jìn)化程度，大瑤山野生茶兒茶素總量、酯型兒茶素、非酯型兒茶素的H′分別為3.08、3.11、3.01，說明大瑤山野生茶樹進(jìn)化類型跨度大。一般情況下，咖啡堿是茶葉中含量最高的生物堿，大瑤山野生茶樹咖啡堿的H′為3.86，其咖啡堿亦具有豐富的遺傳多樣性。

分別從六巷上古陳屯、羅運(yùn)白牛屯、共和坤林屯隨機(jī)選取6個(gè)單株根據(jù)生化成分做聚類分析，可將大瑤山野生茶為3類。第一類為DYS14、16、17、18、19、20，均來自羅運(yùn)白牛屯；第二類為DYS24、25、26、27、28、29，均來自共和坤林屯；第三類為1、2、5、9、10、12，均來自六巷上古陳屯。來自同一地區(qū)的單株聚為一類，說明大瑤山野生茶具有顯著的地域獨(dú)特性，每個(gè)地域之間的差異明顯(圖1)。

表1 主要生化成分特征值

圖1 大瑤山野生茶樹聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis on wild tea plants from Mt. Dayao

2.2 大瑤山野生茶樹資源生化特異性評(píng)價(jià)

在29份單株野生茶中，水浸出物含量在50%以上的有5個(gè)單株，其中白牛3個(gè)、六巷2個(gè)。游離氨基酸總量在4%以上有9個(gè)，其中，六巷5個(gè)、共和4個(gè)?？Х葔A具有降血糖、抗抑郁、提高神經(jīng)活動(dòng)的興奮性等功效[17-18]，其含量超過5%的種質(zhì)資源稱為高咖啡堿資源[19]，大瑤山野生茶樹的咖啡堿平均值為5.77%，有望成為選育高咖啡堿茶樹的種質(zhì)資源。高咖啡堿資源有23個(gè)，其中六巷13個(gè)、共和6個(gè)、白牛4個(gè)。茶多酚與游離氨基酸的比值稱為酚氨比，是指示茶葉試制性、制茶品質(zhì)的重要指標(biāo)。茶樹鮮葉的化學(xué)成分與制茶品質(zhì)息息相關(guān)，鮮葉的化學(xué)組成可以指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，為確定茶葉的生產(chǎn)季節(jié)、加工工藝奠定基礎(chǔ)。酚氨比的范圍在5.15～14.24之間，其中酚氨比平均值最高的為DYS 18，最低為DYS29。適制綠茶的有12個(gè)，六巷7個(gè)，白牛1個(gè)，共和4個(gè)。紅綠茶兼制的有14個(gè)，六巷4個(gè)，白牛9個(gè)，共和1個(gè)。說明大瑤山野生茶中既有適制綠茶的品種，也有適制紅茶的品種。

表2 基于生化成分的特異資源

3 結(jié)論與討論

大瑤山野生茶樹資源在生化成分不僅含量豐富且變化幅度非常大，與大瑤山的地理環(huán)境密切相關(guān)。大瑤山主體山脈，山高谷深，云霧繚繞，土壤有機(jī)質(zhì)豐富，這樣特有的地理生態(tài)環(huán)境有利于形成十分豐富的茶樹種質(zhì)資源。原始型的茶樹兒茶素組成中以非酯型兒茶素為主，進(jìn)化型的茶樹兒茶素則以酯型兒茶素為主[24]。一方面兒茶素類型指示著茶樹的進(jìn)化狀態(tài)；另一方面，兒茶素類型與茶葉滋味、茶葉保健功效密切相關(guān)。酯型兒茶素較非酯型兒茶素苦澀味更重，抗氧化效果更加突出[25]。大瑤山野生茶樹的29個(gè)單株酯型兒茶素與非酯型兒茶素的含量比例變異較大，且非酯型兒茶素遺傳多樣性指數(shù)更大。綜合茶樹資源的進(jìn)化軌跡[26]和此研究的生化成分聚類結(jié)果以及地理環(huán)境和形態(tài)調(diào)查可推測，大瑤山野生茶樹資源處在進(jìn)化與原始之間，存在豐富的遺傳多樣性和地域的獨(dú)特性。

由于EGCG能夠抗氧化，提高堿性磷酸酶活性[20]，高 EGCG 茶在國內(nèi)外市場有著廣闊的發(fā)展前景[21, 22]，DYS11、DYS12、DYS3為高EGCG資源。DYS11為高酯型兒茶素單株，高酯型兒茶素的單株可作為品質(zhì)遺傳改良或直接應(yīng)用于提取酯型兒茶素的重要材料。氨基酸是構(gòu)成茶葉品質(zhì)重要化學(xué)成分，與茶葉嫩度和香氣的形成有密切關(guān)系，對(duì)茶湯的滋味、香氣和色澤的形成具有重要作用。而茶葉中的主要氨基酸茶氨酸具有安神、降壓、增強(qiáng)免疫等多種生理功能，高茶氨酸茶樹具有重要價(jià)值[23]。大瑤山野生茶游離氨基酸總量較豐富，平均值為3.60%，其原因可能是大瑤山具有相對(duì)低溫、高濕的氣候特征，有助于氨基酸等含氮物質(zhì)的生物合成。這些特異的野生茶樹資源即可成為培育特用商業(yè)品種的育種材料，也可作為雜交親本材料。

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Biochemicals in Leaves of Wild Tea Plants in Mt. Dayao

JIANG Chen-kai, ZHAO Wen-fang, HUANG Ya-hui*, ZENG Zhen, WU Chun-lan, LAI Xin-fei, YUAN Si-si
(CollegeofHorticulture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

Nineteen characteristic biochemicals in 29 leaf samples from varied wild tea plants found in Mt. Dayao were studied. Contents of polyphenols, free amino acids and flavonoids were determined using ultraviolet and visible spectrophotometry; constituents of catechins and alkaloids, using high performance liquid chromatography (HPLC); and, components of amino acids, using an amino acid analyzer. Subsequently, genetic diversity and cluster analysis were performed on the biochemical components. The result showed that the wild tea plants were genetically significantly diversified with unique regional characteristics. For instance, the leaves of 9 tea germplasms showed high amino acid contents (>4.00%), 23 had high caffeine contents (>5.00%), and 3 had high epigallocatechin gallate (EGCG) contents (>10%).

wild tea plants; biochemical characteristics; cluster analysis

2017-11-24初稿；2017-01-21修改稿

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020201003、2015B020202007、2016A020208012、2016A020210070)；廣東省產(chǎn)業(yè)體系(2016LM1117)；桂科(AB16380063)。

蔣陳凱(1990-)，女，碩士研究生。研究方向：茶葉深加工及類茶植物資源。E-mail:greenbreezekai@126.com

*通信作者：黃亞輝(1969-)，博士，研究員。研究方向：茶葉深加工、茶樹資源調(diào)查與品種選育。 E-mail:13501513191@163.com

S571.1

A

2096-0220(2016)02-0008-05