側(cè)孢短芽孢桿菌A60的篩選及其對(duì)辣椒疫霉的室內(nèi)防效測(cè)定

郝楠 仝贊華 邱德文

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081）

側(cè)孢短芽孢桿菌A60的篩選及其對(duì)辣椒疫霉的室內(nèi)防效測(cè)定

郝楠 仝贊華 邱德文

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081）

采用平板對(duì)峙法對(duì)分離自海南43份土樣的700余株細(xì)菌進(jìn)行篩選，獲得一株對(duì)辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）具有高效抑制活性的拮抗菌A60，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA 序列分析鑒定其為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。分別在辣椒和甜椒上進(jìn)行室內(nèi)防效測(cè)定，結(jié)果表明，加入拮抗菌A60的辣椒，在第3天時(shí)未發(fā)病，對(duì)辣椒疫霉病的防效達(dá)100%，第5天時(shí)為95.71%，第7天仍可達(dá)到92.22%；加入拮抗菌A60的甜椒，在第3天時(shí)未發(fā)病，防效達(dá)100%，第5天時(shí)為75.26%，第7天仍達(dá)73.20%，說(shuō)明拮抗菌A60能夠明顯的降低發(fā)病率和病情指數(shù)，具有較好的防病持效性。

辣椒疫霉；側(cè)孢短芽孢桿菌；生物防治

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引發(fā)的一種土傳性病害，主要危害辣椒的莖、葉和果實(shí)，侵染后可造成植株萎蔫、落葉和果實(shí)腐爛［1］。一旦發(fā)病，傳播迅速，對(duì)辣椒生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅，常造成辣椒減產(chǎn)20%-30%，甚至造成毀田絕收，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和質(zhì)量［2］。當(dāng)前生產(chǎn)上主要采用甲霜靈、霜脲氰等內(nèi)吸化學(xué)殺菌劑進(jìn)行防治，但疫霉菌對(duì)使用過(guò)的內(nèi)吸殺菌劑極易產(chǎn)生抗藥性，而化學(xué)藥劑防治為主的防治措施還會(huì)產(chǎn)生藥劑殘留以及環(huán)境污染等問(wèn)題［3-5］。所以，對(duì)辣椒疫病進(jìn)行生物防治是當(dāng)前辣椒生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。

目前，對(duì)辣椒疫病生物防治功能菌株的研究主要集中在生防細(xì)菌、木霉及放線菌等［6-8］。側(cè)孢短芽孢桿菌是一種多功能菌株，能產(chǎn)生多種具有應(yīng)用潛力的代謝產(chǎn)物，如殺蟲(chóng)蛋白、抑菌物質(zhì)、抗癌免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，另外側(cè)孢短芽孢桿菌還具有解磷、解鉀、固氮等多種生物學(xué)功能［9，10］。但是，利用側(cè)孢短芽孢桿菌防治辣椒疫病的研究較少。本研究以辣椒疫霉為靶標(biāo)，從海南省多地采集43份土樣中分離和篩選出對(duì)其具有較高抑制活性的菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行鑒定和室內(nèi)的生防效果測(cè)定，以期為辣椒疫病的生物防治提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici），由本實(shí)驗(yàn)室保存；供試?yán)苯菲贩N分別為尖椒1號(hào)（Capsicum annuum L.）和津福42（Capsicum fructescens L.）。

1.2 方法

1.2.1 土樣中細(xì)菌的分離與單菌落純化 采用平板稀釋法［11］分離、純化采集自海南多地的43份土樣。分別用無(wú)菌水將各土壤樣品稀釋至 10-4、10-5和10-6g/mL，用移液管吸取 0.1 mL土壤稀釋液涂布到PB培養(yǎng)基上，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后挑取不同單菌落，用分區(qū)劃線法分別接種到不同的細(xì)菌培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)。24-48 h 觀察記錄平板上長(zhǎng)出的菌落。挑取單菌落在PB培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)。24-48 h 后觀察第1 次劃線純化培養(yǎng)菌落，再同法進(jìn)行第 2 次、第3次劃線純化培養(yǎng)。經(jīng)表形觀察和鏡檢沒(méi)有雜菌后，分別保存于新鮮試管斜面。1.2.2 辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選 采用平板對(duì)峙法［12］篩選辣椒疫霉的拮抗菌。用5 mm打孔器沿PDA培養(yǎng)基上辣椒疫霉菌菌落邊緣打孔，挑取生長(zhǎng)速度較一致的病原菌塊，接種到新的PDA培養(yǎng)基平板中心，置28℃培養(yǎng)48 h后，以病原菌為圓心在平板的背面打“十”字格，以2.8 cm為半徑，用接種針?lè)謩e點(diǎn)接純化后的不同細(xì)菌菌株于十字格的4點(diǎn)上，置于28℃培養(yǎng)，測(cè)量并記錄48-96 h平板上的抑菌圈半徑，通過(guò)比較不同菌株的抑菌圈半徑判斷抑菌性，從中挑選出抗性最強(qiáng)的菌株。

1.2.3 拮抗菌的生理生化特征 將拮抗菌A60劃線接種于固體PB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察拮抗菌的菌落形態(tài)。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13］對(duì)拮抗菌進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、酪氨酸水解、淀粉水解、氧化酶、接觸酶、吲哚反應(yīng)等生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4 16S rDNA序列分析鑒定 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒DP302（天根生化科技有限公司）進(jìn)行基因組DNA的提取，以此DNA為模板，以27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，進(jìn)行菌株16S rDNA的擴(kuò)增［14］。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。委托上海生工生物有限公司對(duì)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)（Blast），通過(guò)MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［15］。

1.2.5 拮抗菌A60對(duì)辣椒果實(shí)的室內(nèi)防效測(cè)定 將保存的A60菌株于LB固體培養(yǎng)基平板上活化24 h，挑取單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，為種子瓶。按1%接種量，接入盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，得到A60培養(yǎng)液。用無(wú)菌水稀釋成1×107CFU/mL濃度備用。用打孔器在生長(zhǎng)5 d的辣椒疫霉病菌邊緣打孔，取菌塊接入裝有50 mL 無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，28℃、180 rpm搖床震蕩培養(yǎng)10 min，再用無(wú)菌水稀釋成濃度為1×106CFU/mL的孢子懸液備用。

將辣椒果實(shí)和甜椒果實(shí)進(jìn)行表面消毒：75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水清洗3次。用滅菌的槍頭打孔，每個(gè)果實(shí)表面6個(gè)孔，每個(gè)處理10個(gè)果實(shí)。處理組A60培養(yǎng)液濃度分別為1×107、5×106、1×106、5×105和1×105CFU/mL，先在孔中分別加入20 μL無(wú)菌發(fā)酵液，2 h后加入20 μL 1×106CFU/mL的辣椒疫霉菌孢子懸液，僅接種辣椒疫霉菌組為陽(yáng)性對(duì)照CK1，無(wú)菌水為陰性對(duì)照CK2。測(cè)定拮抗菌A60對(duì)辣椒疫病的防治效果，黑暗保濕48 h，28℃恒溫培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無(wú)??；1級(jí)，1個(gè)發(fā)病孔；2級(jí)，2個(gè)發(fā)病孔；3級(jí)，3個(gè)發(fā)病孔；4級(jí)，4個(gè)發(fā)病孔；5級(jí)，5-6個(gè)發(fā)病孔。

病情指數(shù)（%）={Σ［（各級(jí)病果數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）］/調(diào)查總果數(shù)×5}×100%

防治效果（%）={［陽(yáng)性對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)］/陽(yáng)性對(duì)照病情指數(shù)}×100%

2 結(jié)果

2.1 辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選

從43份土樣中共分離得到700余株菌株，其中對(duì)辣椒疫霉菌具有拮抗作用的菌株73株（表1），其中抑制效果最好是菌株A60，抑菌圈半徑為11.63 mm（圖1）。該菌種保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No.5694。

2.2 拮抗菌株A60的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)和生理生化指標(biāo) 拮抗菌A60光學(xué)顯微鏡觀察菌落大小為（0.5-1.0）μm×（2.0-5.0）μm，芽孢側(cè)生；在固體PB培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黃褐色、扁平狀、邊緣光滑、中央略凸起；革蘭氏染色結(jié)果可變，延遲期為G-、對(duì)數(shù)期為G+、穩(wěn)定期為G-。通過(guò)生理生化鑒定結(jié)果（表2），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，將拮抗菌A60 初步鑒定為短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）。

表1 73株活性菌株對(duì)辣椒疫霉抑菌圈半徑

圖1 拮抗菌株A60抑菌效果

表2 菌株A60的生理生化特征

2.2.2 16S rDNA 序列鑒定 該菌株的16S rDNA核苷酸序列長(zhǎng)度為1 526 bp，通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)拮抗菌A60菌株與側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）的同源性相似性為99%。以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），可以看出A60與側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus HQ412764.1）親緣關(guān)系最接近。綜合生理生化特征及16S rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，拮抗菌株A60鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。

圖2 菌株A60依據(jù)16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 側(cè)孢短芽孢桿菌A60對(duì)辣椒果實(shí)疫霉病的室內(nèi)防效

2.3.1 側(cè)孢短芽孢桿菌A60在辣椒果實(shí)上的防效 防效結(jié)果（表3）表明，加入濃度為1×107CFU/mL和5×106CFU/mL拮抗菌A60的辣椒，在第3 d時(shí)未發(fā)病，防效可達(dá)到100%，第5天和第7天仍可達(dá)到90% 以上防效；加入濃度為5×105CFU/mL和1×105CFU/mL拮抗菌A60的辣椒在第3天、第5天和第7天發(fā)病率均低于對(duì)照組，但防效明顯降低，說(shuō)明高濃度拮抗菌A60能夠有效的降低發(fā)病率和病情指數(shù)，并且具有很好的持效性，低濃度拮抗菌A60也可以提供防治作用。

2.3.2 側(cè)孢短芽孢桿菌A60在甜椒果實(shí)上的防效 防效結(jié)果（表4）表明，加入高濃度拮抗菌A60的甜椒，在第3天時(shí)未發(fā)病，達(dá)到100%，第5天時(shí)75.26%，第7天仍可達(dá)到73.20%；當(dāng)拮抗菌A60濃度降低為5×106CFU/mL時(shí)，在第3天和第5天時(shí)防效與高濃度無(wú)顯著性差異，但當(dāng)?shù)?天時(shí)防效明顯降低，說(shuō)明低濃度持效性有所降低；當(dāng)拮抗菌A60濃度低于5×105CFU/mL時(shí)，無(wú)明顯防治效果。說(shuō)明拮抗菌A60能夠降低發(fā)病率和病情指數(shù)，并且高濃度時(shí)具有較好的持效性，但在甜椒上的防治效果比在辣椒上的稍差一些，使用時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加濃度。

3 討論

近年來(lái)，側(cè)孢短芽孢桿菌作為一種多功能菌株，在生物防治、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)學(xué)等方面都顯示了巨大的應(yīng)用價(jià)值和研究前景。作為最具潛力的生防菌株之一，側(cè)孢短芽孢桿菌可產(chǎn)生豐富的抗菌物質(zhì)，如蛋白類(lèi)、脂肽類(lèi)化合物、芽孢菌胺、聚酮類(lèi)化合物等，對(duì)多種真菌和細(xì)菌都表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性［16］。李?lèi)偟龋?7］研究表明側(cè)孢短芽孢桿菌B8胞外抗菌蛋白可有效抑制立枯絲核菌和辣椒疫霉菌菌絲生長(zhǎng)，并引起菌絲畸形。張丹等［18］研究表明側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9對(duì)大多數(shù)致病性細(xì)菌及部分真菌都具有抑制作用，其中對(duì)G+菌的抑菌效果強(qiáng)于G-菌，抑菌機(jī)制主要是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用和產(chǎn)生抗菌肽。側(cè)孢短芽孢桿菌還可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，李蔚等［19］用側(cè)孢短芽孢桿菌B8胞外抗菌蛋白處理辣椒4 d后，植株產(chǎn)生 PR蛋白，說(shuō)明側(cè)孢短芽孢桿菌可誘導(dǎo)辣椒產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。另外，苗素平［20］研究表明添加側(cè)孢短芽孢桿菌的微生物肥料，可有效改善土壤肥力、促進(jìn)作物生長(zhǎng)。朱金英等［21］在綠源有機(jī)肥中添加不同比例的海洋側(cè)孢短芽孢桿菌（AMCC100018）可有效促進(jìn)黃瓜植株生長(zhǎng)、改善黃瓜果實(shí)的品質(zhì)。

表 3 側(cè)孢短芽孢桿菌A60在辣椒果實(shí)上的防效

表4 拮抗菌A60在甜椒果實(shí)上的防效

綜上所述，側(cè)孢短芽孢桿菌具有抑菌能力強(qiáng)、抑菌范圍廣、生長(zhǎng)快速等特點(diǎn)，還可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)，其菌體及抑菌代謝產(chǎn)物均可制成優(yōu)良的生防菌劑。本研究將側(cè)孢短芽孢桿菌A60的菌懸液分別稀釋不同倍數(shù)進(jìn)行室內(nèi)的防效試驗(yàn)，結(jié)果表明，拮抗菌A60能夠明顯降低辣椒、甜椒上辣椒疫病的發(fā)病率和病情指數(shù)，并且具有很好的持效性。為了更好的進(jìn)行田間應(yīng)用，應(yīng)進(jìn)一步確定其抑菌調(diào)控體系以及抑菌物質(zhì)在植物、病原物和生防菌三者之間發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制。隨著測(cè)序技術(shù)的逐漸發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可利用基因組學(xué)尤其是功能基因組學(xué)，包括轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝物組學(xué)、比較基因組學(xué)來(lái)研究其生防機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié)論

本研究從43份海南土樣中分離、篩選出了73株對(duì)辣椒疫霉病菌有拮抗作用的細(xì)菌A1-A73，其中A60抑菌活性最高，對(duì)辣椒疫霉的抑菌圈半徑達(dá)11.63 mm。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定其為側(cè)孢短芽孢桿菌。分別在辣椒和甜椒上進(jìn)行側(cè)孢短芽孢桿菌A60的室內(nèi)防效測(cè)定，結(jié)果表明，拮抗菌A60能夠明顯的降低發(fā)病率和病情指數(shù)，具有較好的防病持效性。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Isolation of Brevibacillus laterosporus A60 and Its Greenhouse Control Efficiency Against Phytophthora capsica

HAO Nan TONG Zan-Hua QIU De-Wen
（The Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

A60 strain with high inhibition rate against Phytophthora capsici was screened from 700 strains isolated from 43 soil samples in Hainan province. The A60 strain was identified as Brevibacillus laterosporus based on physiological and biochemical characteristics and a 16S rDNA gene sequence analysis. The control effects of A60 strain against Phytophthora on Capsicum annuum and Capsicum fructescens were determined in greenhouse. The results showed that the biocontrol efficacy of A60 strain on C. annuum L. were 100%，95.71% and 92.22% at 3rd，5th and 7th day，respectively. The control efficacy on C. fructescens were 100%，75.26% and 73.20% at 3rd，5th and 7th day，respectively. Our results highlight that the application of B. laterosporus A60 significantly reduce morbidity and disease index，i.e.，control efficacy is solid.

Phytophthora capsici；Brevibacillus laterosporus；biocontrol

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0210

2017-03-20

郝楠，男，碩士研究生，研究方向：生物農(nóng)藥；E-mail：275569832@qq.com

邱德文，男，博士，研究員，研究方向：生物農(nóng)藥；E-mail：qiudewen@caas.cn