王翠翠陳建玲唐子華邱世偉張翠李亮郭維維楊仕明王金福

1浙江大學(xué)紫金港校區(qū)，生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞與發(fā)育研究所（杭州310058）

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻喉研究所（北京100853）

·基礎(chǔ)研究·

iPSCs定向分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞與支持細(xì)胞間相互作用的研究

王翠翠1陳建玲1唐子華1邱世偉2張翠1李亮1郭維維2楊仕明2王金福1

1浙江大學(xué)紫金港校區(qū)，生命科學(xué)學(xué)院，細(xì)胞與發(fā)育研究所（杭州310058）

2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻喉研究所（北京100853）

目的利用誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞定向分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞探究這兩種體外誘導(dǎo)分化細(xì)胞之間的相互作用。方法首先，利用細(xì)胞單層貼壁兩步誘導(dǎo)法將三株iPS細(xì)胞（野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株）向內(nèi)耳祖細(xì)胞及內(nèi)耳毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化，探究iPSCs定向分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的過程中是否有支持細(xì)胞的產(chǎn)生；其次，通過細(xì)胞免疫化學(xué)的方法探究體外分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞間的相互作用;最后，將表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）的上皮樣內(nèi)耳祖細(xì)胞以圓窗膜穿刺的方法移植到白化榮昌豬的內(nèi)耳中觀察分析移植細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、分化以及在體內(nèi)形成的聯(lián)系。結(jié)果三株iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞的過程中均有一部分細(xì)胞分化為支持細(xì)胞；對分化細(xì)胞進(jìn)行E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，E-cadherin、N-cadherin和ZO-1在支持細(xì)胞-支持細(xì)胞連接和支持細(xì)胞-毛細(xì)胞連接間都有表達(dá)；移植4周后，耳蝸免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，三株不同來源的移植細(xì)胞均有少量細(xì)胞成功遷移到了毛細(xì)胞受損部位—柯底氏器，并表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志性蛋白MYO7A。移植細(xì)胞之間以及移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達(dá)。結(jié)論iPSCs誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞在體內(nèi)、外均能形成鈣粘連接和緊密連接。這些研究結(jié)果對毛細(xì)胞取代法治療耳聾策略的完善與發(fā)展有一定的科學(xué)意義。

耳聾;誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPSCs）;毛細(xì)胞;支持細(xì)胞;細(xì)胞間連接

Fund projects：the grants from National Basic Research Program of China(2014CB541705);Chinese National Science Foundation(81570932);Strategically Guiding Scientific Special Project from ChineseAcademy of Sciences(XDA04020202-23);National Development Program of Important Scientific Instrument(2013YQ030595);Opening Foundation of the State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals andApplication(SMFA12K02);TZ-1Application Program(KYTZ01-0901-FB-003).

Disclosure of potential conflicts of interest:Authors indicate no potential conflicts of interest.

耳聾多數(shù)情況下由環(huán)境因素引起，比如頻繁暴露在高強度的聲音環(huán)境中、病毒感染和耳毒性藥物等等。由內(nèi)耳毛細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的缺失或損傷而導(dǎo)致的耳聾被稱為感音性耳聾，這是聽力損傷中最常見的一種，影響著全世界數(shù)以百萬計的人[1]。成體哺乳動物的耳蝸毛細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，不具有再生修復(fù)能力，故由因其損傷引起的感音神經(jīng)性耳聾通常是不可逆的[2]。目前，針對感音性耳聾病人的常規(guī)療法主要是加裝助聽器和植入人工耳蝸，但由于毛細(xì)胞的不可再生性，這些手段并不能從病理上根治耳聾。近年來干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為耳聾的治療提供了一個嶄新的更具前景性的方向[3,4]。胚胎干細(xì)胞（ESCs）和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPSCs）在體外已經(jīng)被成功誘導(dǎo)成內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞[5,6]。近來有研究表明基因突變導(dǎo)致毛細(xì)胞損傷的耳聾病人來源的特異性iPSCs經(jīng)基因校正后能產(chǎn)生形態(tài)和功能均正常的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞[7,8]。這種把誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）技術(shù)和基因校正技術(shù)結(jié)合的研究將為毛細(xì)胞取代法治療感音性耳聾提供無限可能。

耳蝸螺旋器（Organ of Corti）是感受聲音刺激的聽覺感受器，主要由毛細(xì)胞和支持細(xì)胞組成。毛細(xì)胞不能直接附著在基底膜上，而是由支持細(xì)胞所依托和包繞，這說明毛細(xì)胞在機(jī)械和生理很大程度上由支持細(xì)胞維持[9]。不同于毛細(xì)胞僅僅是附著在基底膜的表面，支持細(xì)胞可以橫跨整個基底膜。支持細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞和毛細(xì)胞之間通過鈣粘連接和緊密連接建立起聯(lián)系[10,11]，支持細(xì)胞之間還可以通過間隙連接進(jìn)行離子交換[12]。支持細(xì)胞在感覺上皮發(fā)揮著重要的作用，不僅可以維持感覺器官結(jié)構(gòu)的完整性，而且可以維持上皮細(xì)胞的生存環(huán)境使毛細(xì)胞可以正常發(fā)揮功能[13]。支持細(xì)胞在非哺乳動物毛細(xì)胞損傷后的感覺修復(fù)方面也發(fā)揮了重要的作用。在非哺乳動物中，支持細(xì)胞利用有絲分裂再生和非有絲分裂再生兩種機(jī)制來代替受損的毛細(xì)胞[13]。某些情況下，支持細(xì)胞作為祖細(xì)胞可進(jìn)入細(xì)胞周期，持續(xù)分裂產(chǎn)生出成熟的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，以替代消失的毛細(xì)胞；其他情況下，支持細(xì)胞還可以不通過有絲分裂直接轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞。相比之下，在哺乳動物和人類的前庭系統(tǒng)，在毛細(xì)胞損害后出現(xiàn)非常有限的祖細(xì)胞分裂為再生的毛細(xì)胞，而在耳蝸系統(tǒng)，毛細(xì)胞不可再生。

因此，深入了解iPSCs誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系是iPSCs用于毛細(xì)胞功能修復(fù)研究的重要前提條件。本文中，我們采用三株iPS細(xì)胞（野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株）進(jìn)行內(nèi)耳毛細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。首先，鑒定了在iPSCs定向誘導(dǎo)分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的過程中同時產(chǎn)生了支持細(xì)胞。其次，通過檢測鈣粘連接蛋白（E-cadherin、N-cadherin）和緊密連接蛋白（ZO-1）的存在與分布初步確定體外誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的關(guān)系。最后，我們將表達(dá)EGFP的上皮樣祖細(xì)胞通過圓窗膜穿刺的方法移植到白化榮昌豬的內(nèi)耳中觀察分析細(xì)胞的遷移、分化以及細(xì)胞連接。

1 材料和方法

1.1實驗細(xì)胞株和動物模型

所有的實驗過程包括涉及到的動物都通過了杭州市浙江大學(xué)倫理審查委員會的批準(zhǔn)。由浙江省衛(wèi)生局批準(zhǔn)，并且經(jīng)過浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院倫理委員會同意，我們成功采集到正常非耳聾患者、MYO7A雜合雙突變耳聾病人的及其父母的尿液。C-iPSCs由正常非耳聾患者（MYO7AWT/WT）的尿液細(xì)胞經(jīng)重編程誘導(dǎo)生成；P-iPSCs由MYO7A雜合雙突變耳聾病人（MYO7A c.1184 G＞A和MYO7A c.4118 C＞T）的尿液細(xì)胞經(jīng)重編程誘導(dǎo)生成；CP-iP?SCs是利用 CRISPR-Case9技術(shù)將 P-iPSCs中c.4118C＞T突變位點校正之后得到的細(xì)胞株[7]。

Mitf-M基因突變的白化榮昌豬是由中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻喉研究所提供，豬齡8周左右，體重約10Kg。

1.2實驗方法

1.2.1 iPS細(xì)胞向內(nèi)耳祖細(xì)胞及進(jìn)一步向內(nèi)耳毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化

本研究中，我們利用細(xì)胞單層貼壁兩步誘導(dǎo)法[6]，首先用 FGF3和 FGF10處理人iPS細(xì)胞10-12天，使其分化為內(nèi)耳上皮樣祖細(xì)胞。在第二步的向毛細(xì)胞方向誘導(dǎo)過程中，我們將細(xì)胞接到用laminin包被過的細(xì)胞爬片上，用添加了全反式視磺酸和EGF的雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)20天，這種誘導(dǎo)方法已經(jīng)證實可以產(chǎn)生具有靜纖毛束和電生理特性的毛細(xì)胞樣細(xì)胞[15]。

1.2.2內(nèi)耳祖細(xì)胞、內(nèi)耳毛細(xì)胞的基因表達(dá)檢測

使用Trizol試劑（TaKaRa）提取待檢測樣本的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas）從2μg總RNA合成cDNA，用作聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）中的模板。推薦的引物和產(chǎn)物大小見表1。使用瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像分析系統(tǒng)分析反應(yīng)產(chǎn)物。使用Im?age J軟件對帶強度進(jìn)行半定量分析。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real time-PCR

1.2.3細(xì)胞免疫熒光

待測樣品用4%多聚甲醛室溫下固定15min，0.01M PBS洗滌3次，每次5min；0.25%TritonX-100室溫下孵育樣品10min，0.01M PBS洗滌3次，每次5min；1%牛血清白蛋白封閉1h。加入一抗(an?ti-PAX8，1：100，Abcam；anti-PAX2，1：250，Abcam；anti-Nestin，1：250，Abcam；anti-SOX2，1：900，Ab?cam；anti-ATOH1，1：500，Abcam；anti-BRN3C，1：50，Abcam；anti-Myosin 7a，1：500，Abcam；anti-Espin，1:200，Santa Cruz；anti-p27 Kip1，1：100，R&D System；anti-ZO-1，1：100，Thermos Fisher；an?ti-E-cadherin，1:50，BD Biosciences；anti-N-cad?herin，1:50，BD Biosciences)4℃孵育過夜。0.01M PBS洗滌3次，每次5min。加入1:400二抗（Alexa Flour 594，Alexa Flour 488，Alexa Flour 405，Jack?son）避光室溫孵育1h。0.01M PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚;Beyo?time），避光室溫作用1min，0.01M PBS洗滌5min。封片，進(jìn)行共聚焦掃描成像。

1.2.4 穩(wěn)定表達(dá) EGFP的上皮樣祖細(xì)胞（EGFP-OEPs）的制備及移植

慢病毒感染的方法使iPS細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記蛋白EGFP，得到穩(wěn)定的EGFP-iPS細(xì)胞株；由EGFP-iPS誘導(dǎo)分化了12天的內(nèi)耳祖細(xì)胞利用差異消化法去除祖細(xì)胞中較早消化下來的神經(jīng)祖細(xì)胞（ONPs)，收集之后消化下來的上皮樣內(nèi)耳祖細(xì)胞（OEPs）用DMEM/F12配制成1×105個/μl的細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?。對動物的右耳進(jìn)行手術(shù)，暴露圓窗，將提前準(zhǔn)備好的EGFP-OEPs細(xì)胞懸液輕輕吹打均勻，吸入10μl于微量進(jìn)樣器中，刺穿圓窗膜將細(xì)胞懸液緩慢注入耳蝸鼓階，用明膠海綿填塞圓窗龕，逐層縫合切口，碘伏消毒傷口。

1.2.5組織學(xué)切片免疫化學(xué)分析

榮昌豬經(jīng)4%多聚甲醛灌注后，解剖內(nèi)耳取出耳蝸；將耳蝸浸泡在4%多聚甲醛中固定過夜；10%EDTA常溫脫鈣4周；0.01M PBS緩沖液漂洗后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中4℃脫水過夜；0.01M PBS緩沖液漂洗后浸泡在OCT包埋劑中4℃過夜后進(jìn)行冷凍切片。0.01M PBS緩沖液漂洗三遍，每遍15min，洗去OCT包埋劑，5%BSA室溫封閉1h，加入一抗（anti-EGFP,1：3000,Abcam;anti-Myosin VIIa,1：500，Abcam;anti-ZO-1,1：100，Thermos Fisher;anti-E-cadherin,1:50，BD Biosciences;an?ti-N-cadherin,1:50，BD Biosciences）4℃孵育過夜。0.01M PBS洗滌3次，每次15min。加入1:400二抗（Alexa Flour 594，Alexa Flour 488，Alexa Flour 674，Jackson）避光室溫孵育1h，0.01M PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚;Be?yotime，），避光室溫作用1min，0.01M PBS洗滌5min。封片，進(jìn)行共聚焦掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 iPS細(xì)胞向內(nèi)耳祖細(xì)胞及進(jìn)一步向內(nèi)耳毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化

三株不同來源的iPS細(xì)胞通過單層貼壁誘導(dǎo)分化的方法，在FGF3和FGF10同時存在的內(nèi)耳祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)12天后進(jìn)行基因檢測和免疫熒光檢測。RT-PCR分析顯示，Pax2以及內(nèi)耳早期發(fā)育特異性基因（如Pax8，Dlx5，Six1，Eya-1和GATA3）在誘導(dǎo)細(xì)胞中均表達(dá)（圖1A）；三株細(xì)胞分化來的內(nèi)耳祖細(xì)胞在基因表達(dá)方面并無明顯差異（圖1B，P＞0.05）。對內(nèi)耳祖細(xì)胞標(biāo)志性基因PAX8和PAX2（圖1C），PAX8和SOX2（圖1D），PAX8和Nestin（圖1E），進(jìn)行免疫共標(biāo)檢測，結(jié)果表明，三株iPS細(xì)胞均能誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞。

圖1 內(nèi)耳祖細(xì)胞檢測結(jié)果。（A）C-iPS細(xì)胞株，P-iPS細(xì)胞株，CP-iPS細(xì)胞株來源的內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)志性基因PAX2，PAX8，GATA3，EYA1，SIX1和DLX5的RT-PCR檢測。GAPDH的表達(dá)量作為對照。（B）對三株來源的內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)志性基因的表達(dá)進(jìn)行量化分析，GAPDH的表達(dá)量作為對照。誤差線代表方差（n=3）。（C-E）三株iPS細(xì)胞株來源的內(nèi)耳祖細(xì)胞標(biāo)志性基因PAX8和PAX2（C），PAX8和SOX2（D），PAX8和Nestin（E）的免疫共標(biāo)檢測。比例尺為10μm。Fig.1 Identification of otic progenitors differentiated from human iPSCs.(A)RT-PCR analysis of the expression of early otic progenitor marker genes PAX2,PAX8,GATA3,EYA1, SIX1,and DLX5 in cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs.(B)The relative gene expression levels were quantified and plotted.The housekeeping gene GAPDH was used as an internal reference.Error bars represent the S.D.(n=3). (C-E)Co-expression of otic markers PAX8+PAX2(C), PAX8+SOX2(D),PAX8+NES(E)in otic progenitors derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs.Scale bars=10 μm.Nuclei were stained with DAPI(blue).

收集OEPs并在補充有EGF和全反式視黃酸的雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后進(jìn)行基因檢測和免疫熒光檢測。RT-PCR分析顯示，在誘導(dǎo)的毛細(xì)胞樣細(xì)胞中表達(dá)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ATOH1和BRN3C、早期毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白MYO7A以及毛束發(fā)育所需的蛋白質(zhì)ESPN（圖2A）；三株細(xì)胞分化來的內(nèi)耳毛細(xì)胞在基因表達(dá)方面并無明顯差異（圖2B，P＞0.05）。我們對內(nèi)耳毛細(xì)胞標(biāo)志性基因BRN3C和ATOH1（圖2C），BRN3C和MYO7A（圖2D），BRN3C和ESPN（圖2E）進(jìn)行免疫共標(biāo)檢測，結(jié)果表明，三株iPS細(xì)胞均有向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化的能力。

圖2 內(nèi)耳毛細(xì)胞檢測結(jié)果。（A）C-iPS細(xì)胞株，P-iPS細(xì)胞株，CP-iPS細(xì)胞株來源的內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)志性基因MYO7A、ATOH1、BRN3C和Espin以及支持細(xì)胞的標(biāo)志性基因p27kip1的表達(dá)情況。GAPDH的表達(dá)量作為對照。（B）對三株來源的內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的標(biāo)志性基因的表達(dá)進(jìn)行量化分析，GAPDH的表達(dá)量作為對照。誤差線代表方差（n=3）。（C-E）三株iPS細(xì)胞株來源的內(nèi)耳毛細(xì)胞標(biāo)志性基因BRN3C和ATOH1（C），BRN3C和MYO7A（D），BRN3C和ESPN（E）的免疫共標(biāo)檢測。比例尺為10μm。

2.2 iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞和支持細(xì)胞間的相互作用

有文獻(xiàn)報道，在內(nèi)耳的發(fā)育過程中，內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞來自于同一種前體細(xì)胞[16]。因此，我們推測在iPS體外誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞的過程中有一部分細(xì)胞分化為支持細(xì)胞。為了證實這一推測，我們將三株不同來源的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的內(nèi)耳毛細(xì)胞固定后用免疫熒光特異性標(biāo)記支持細(xì)胞的標(biāo)志性基因p27kip1。免疫標(biāo)記顯示，分別有13.1%±2.7%、14.1%±2.9%和12.7%±2.7%的細(xì)胞表現(xiàn)為p27kip1和myosin7A雙陽性（圖3 A,B），我們將這類細(xì)胞視為未完全分化的處于分化初期的毛細(xì)胞；分別有7.6%±1.5%、9.1%±0.9%和7.2%± 1.7%的細(xì)胞僅表達(dá)p27kip1，而沒有表達(dá)myosin7A（圖3 C,D），我們將這類細(xì)胞視為支持細(xì)胞[17]。

圖3 誘導(dǎo)分化的毛細(xì)胞體系中MYO7A和p27kip1的免疫熒光檢測。（A）三株來源不同的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞中MYO7A和p27kip1的共標(biāo)檢測。比例尺為20μm。（B）三株來源不同的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞中MYO7A和p27kip1雙陽性細(xì)胞在總體細(xì)胞所占比例的比較分析。誤差線代表方差(n=3)。（C）三株來源不同的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞中p27kip1的檢測。比例尺為20μm。（D）三株來源不同的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞中只表達(dá)p27kip1而不表達(dá)MYO7A的細(xì)胞在總體細(xì)胞所占比例的比較分析。誤差線代表方差（n=3）。Fig.3 Detection of MYO7A and p27kip1 expression.(A)The co-expression of MYO7A and p27kip1 in cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs were evaluated by immunochemistry.Scale bars=20 μm.(B)Percentage of MYO7A and p27kip1 double-positive cells in the total cell population derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs.Error bars represent SD(n=3).(C)The expression of p27kip1 in cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs were evaluated by immunochemistry.Scale bars=20 μm.(D)Percentage of p27kip1 positive cells in the total cell population derived from C-iPSCs, P-iPSCs,andCP-iPSCs.ErrorbarsrepresentSD(n=3).

此后，我們探究誘導(dǎo)分化成的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞之間是否存在形態(tài)上的聯(lián)系。E-cadherin和N-cadherin是鈣粘蛋白家族中存在于鈣粘連接中的兩種經(jīng)典的跨膜糖蛋白，ZO-1是檢測緊密連接的一種常用蛋白。于是，本實驗中我們通過特異性檢測E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的存在和分布來判定毛細(xì)胞和支持細(xì)胞之間在形態(tài)上的關(guān)系。結(jié)果表明E-cadherin（圖4A）、N-cadherin（圖4B）和ZO-1（圖4C）在毛細(xì)胞-支持細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞-支持細(xì)胞之間都存在。

圖4 三株iPS細(xì)胞來源的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞與支持細(xì)胞間細(xì)胞連接。三株不同來源的內(nèi)耳上皮樣內(nèi)耳祖細(xì)胞在lam?inin上誘導(dǎo)分化20天后毛細(xì)胞和支持細(xì)胞之間E-cad?herin（A）、N-cadherin（B）和ZO-1（C）的表達(dá)。其中毛細(xì)胞由MYO7A特異性標(biāo)記，支持細(xì)胞由p27kip1特異性標(biāo)記。比例尺為20μm。Fig.4 Intercellular junctions between hair cell-like cells and supporting cells derived from otic epithelial progenitors.Immunofluorescence of cells induced from otic epithelial progenitors derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs for 3 weeks on laminin showed positive labeling for(A)E-cadherin,(B)N-cadherin and(C)ZO-1 in the junction between hair cell-like cells marked with MYO7A and supporting cells marked with p27Kip1.Scale bars=20 μm.

2.3移植細(xì)胞在白化榮昌豬內(nèi)耳中的遷移、分化及細(xì)胞間連接

移植四周后，免疫組化結(jié)果顯示，移植細(xì)胞大部分以細(xì)胞團(tuán)的形式存在于鼓階，小部分細(xì)胞遷移到了中階，其中只有極小部分細(xì)胞遷移到了毛細(xì)胞損傷部位-柯底氏器（圖5A）。為探究OEPs在耳蝸微環(huán)境中的分化潛能，我們對毛細(xì)胞標(biāo)志物MYO7A進(jìn)行免疫熒光檢測，結(jié)果表明，遷移到柯式器上的細(xì)胞部分呈MYO7A陽性(圖5B)，初步斷定遷移到柯底氏器上的細(xì)胞可以成功分化為毛細(xì)胞。最后，我們特異性檢測鈣粘連接蛋白E-cadherin和N-cadherin以及緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)情況來探究體外已經(jīng)證實過的存在于毛細(xì)胞和支持細(xì)胞之間的鈣粘連接和緊密連接是否在體內(nèi)依然能夠形成，結(jié)果顯示，移植細(xì)胞分化后相互之間依然有E-cadherin（圖6A）、N-cadherin（圖6B）和ZO-1（圖6C）的表達(dá)，且少量移植細(xì)胞與宿主組織之間也有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達(dá)。通過對三株細(xì)胞株的比較發(fā)現(xiàn)，三株不同來源的上皮樣祖細(xì)胞在內(nèi)耳中的遷移、分化以及E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達(dá)和分布方面并沒有明顯的差異。

圖5 移植細(xì)胞在白化榮昌豬內(nèi)耳中的遷移和分化。三株不同來源的表達(dá)EGFP的上皮樣祖細(xì)胞移植到榮昌豬內(nèi)耳四周后，均發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞遷移到了毛細(xì)胞損傷部位-柯式器（A），并且部分細(xì)胞向毛細(xì)胞方向分化（B）。移植細(xì)胞由EGFP的表達(dá)顯示，誘導(dǎo)分化的毛細(xì)胞由MYO7A特異性標(biāo)志，藍(lán)色標(biāo)記的細(xì)胞核用來顯示耳蝸的結(jié)構(gòu)。比例尺為50μm。Fig.5 Migration and differentiation of OEPs transplanted into the inner ear of Rong-Chang swine.(A)Migration of cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs in the organ of Corti of the albino Rong-Chang swine.Scale bars=100 μm.(B)Differentiation of cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs toward inner hair cells in the organ of Corti.Scale bars=50 μm.Grafted cells were visualized by EGFP expression and differentiated hair cells were marked by MYO7A.Nuclei were stained with DAPI(blue).

圖6 移植細(xì)胞在體內(nèi)的連接。三株不同來源的上皮樣內(nèi)耳祖細(xì)胞遷移到柯式器上以后分化細(xì)胞之間以及移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間E-cadherin（A）、N-cadherin（B）和ZO-1（C）的表達(dá)。移植細(xì)胞由EGFP的表達(dá)顯示，誘導(dǎo)分化的毛細(xì)胞由MYO7A特異性標(biāo)志，藍(lán)色標(biāo)記的細(xì)胞核用來顯示耳蝸的結(jié)構(gòu)。比例尺為50μm。Fig.6 Formation of Intercellular junctions by cells transplanted into inner ear.Expression of(A)E-cadherin,(B) N-cadherin and(C)ZO-1 in the cell-cell contact formed by cells derived from C-iPSCs,P-iPSCs,and CP-iPSCs in the organ of Corti.Grafted cells were visualized by EGFP expression and hair cells differentiated were marked by MYO7A. Nuclei were stained with DAPI(blue).Scale bars=50 μm.

3 討論

隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，越來越多的科學(xué)家嘗試?yán)酶杉?xì)胞替換損傷的毛細(xì)胞[18-20]和聽覺神經(jīng)元[21-25]的方法來治療耳聾。Wei Chen等人將hESCs體外誘導(dǎo)分化成的內(nèi)耳祖細(xì)胞移植到成年的耳聾沙鼠模型中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不僅成功分化成了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞，而且產(chǎn)生了實質(zhì)性的功能恢復(fù)，這為將來的基于干細(xì)胞取代的聽覺神經(jīng)性耳聾的治療提供了很有前景的發(fā)展方向[6]。毛細(xì)胞被看作是耳聾治療的重要靶點，它的取代是聽力恢復(fù)的最徹底的治療。然而，幾乎沒有研究表明外源細(xì)胞已成功取代受損的毛細(xì)胞并改善聽覺功能，這可能是由于外源細(xì)胞很難整合進(jìn)宿主組織。在體內(nèi)，支持細(xì)胞可以維持上皮細(xì)胞的生存環(huán)境，對毛細(xì)胞發(fā)揮功能起著重要的作用。因此，深入了解干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系可能會為外源細(xì)胞在宿主組織上的整合提供一定幫助。

在所有的內(nèi)耳感覺上皮中，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的有序排列對于聽力是必須的。在感覺上皮的表面，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的質(zhì)膜通過粘附連接和緊密連接相互作用，形成對柯底氏器的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要的網(wǎng)狀層[11]。粘附連接主要通過機(jī)械的連接相鄰的細(xì)胞以保持組織的完整性，而緊密連接主要是通過形成一個離子滲透屏障來保證內(nèi)淋巴液和外淋巴液的離子環(huán)境[26]。在網(wǎng)狀層中介導(dǎo)接觸的重要分子之一是鈣粘素，一種參與鈣依賴性細(xì)胞間粘附的跨膜糖蛋白家族，這個家族包括E-cad?herin、N-cadherin和P-cadherin。有研究已經(jīng)證明，在成年哺乳動物的柯底氏器上，鈣粘蛋白存在于毛細(xì)胞-支持細(xì)胞異型連接之間和支持細(xì)胞-支持細(xì)胞同型連接之間[10,27]。緊密連接由多種蛋白質(zhì)組成，包括 Occluding[28],claudins[29],zonula oc?cludens ZO）家族和其他細(xì)胞質(zhì)蛋白。緊密連接蛋白ZO-1存在于支持細(xì)胞-毛細(xì)胞異型連接和支持細(xì)胞-支持細(xì)胞同型連接中[11]。于是，我們通過檢測粘附連接蛋白（E-cadherin和N-cadherin）以及緊密連接蛋白（ZO-1）的分布探究體外誘導(dǎo)的毛細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的關(guān)系。

為了探究移植的外源細(xì)胞能否遷移到柯底氏器中并與宿主細(xì)胞建立起聯(lián)系，我們將三株不同來源的上皮樣內(nèi)耳祖細(xì)胞移植到白化耳聾榮昌豬的內(nèi)耳中。以往進(jìn)行的利用細(xì)胞取代策略治療耳聾的研究中，大家常選用小鼠，大鼠和其他嚙齒類動物。而在我們這次的研究中，采用小型豬作為動物模型。與傳統(tǒng)耳科研究中使用的嚙齒類動物相比，小型豬的優(yōu)勢在于其與人類基因組的高度同源性，以及其在內(nèi)耳解剖、內(nèi)耳形態(tài)及電生理等方面與人的相似性[32]。本次實驗采用的榮昌豬具有Mitf-M基因突變，可使血管紋發(fā)生病變，耳蝸發(fā)育不良，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和毛細(xì)胞數(shù)量減少，從而導(dǎo)致感覺神經(jīng)性耳聾[14]。我們這次研究的主要目標(biāo)就是探究移植的外源細(xì)胞在內(nèi)耳中的遷移、分化以及在柯底氏器中細(xì)胞之間建立連接的情況。移植四周后，我們在柯底氏器周圍靠近蓋膜的地方發(fā)現(xiàn)了EGFP標(biāo)記的細(xì)胞，這和以往的研究結(jié)果大體一致[33]。這些結(jié)果表明外源細(xì)胞可以從鼓階遷移到中階。然而，只有極少數(shù)量的細(xì)胞整合到聽覺上皮組織中。這可能是由于我們的動物模型是一種先天性耳聾模型，其耳蝸病變不是急性損傷，因此不能發(fā)生炎癥反應(yīng)，并且在微環(huán)境中沒有炎癥細(xì)胞因子有效地促進(jìn)外源細(xì)胞與聽覺上皮組織的整合[34]。在整個研究過程中，我們均采用三種不同來源的iPS細(xì)胞株同時進(jìn)行實驗，結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，三株不同來源的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的支持細(xì)胞和內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞之間在體外和體內(nèi)均能形成鈣粘連接和緊密連接，并且在E-Cadherin、N-cadherin和ZO-1的表達(dá)和分布方面并無明顯差異。因此，我們初步推測MYO7A基因突變對于毛細(xì)胞和支持細(xì)胞間連接沒有明顯影響。當(dāng)然，在本研究中使用的動物模型不是最佳的，特別是對于源自CP-iPSC的細(xì)胞的移植實驗。我們正在尋找MYO7A突變的動物模型，并將探究CP-iPSC來源的細(xì)胞對體內(nèi)毛細(xì)胞的形態(tài)和功能的恢復(fù)效應(yīng)。

本研究通過一系列實驗得到最終結(jié)論：iPSCs誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能形成鈣粘連接和緊密連接。更好的了解干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的毛細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的關(guān)系有助于基于毛細(xì)胞取代的干細(xì)胞治療耳聾的進(jìn)一步研究和發(fā)展。

1 Strenzke N,Pauli-Magnus D,Meyer A,et al.Update on physiolo?gy and pathophysiology of the inner ear[J].Pathomechanisms of Sensorinerual Hearing Loss,2008,56(1):27–36.

2 Rubel EW,Furrer SA,Stone JS.A brief history of hair cell regen?eration research and speculations on the future[J].Hearing Re?search,2013,297(3):42–51.

3 Peng T,Dong Y,Zhu G,et al.Induced pluripotent stem cells: landscape for studying and treating hereditary hearing loss[J]. Journal of Otology,2014,9(4):151–155.

4 Hu Z,Ulfendahl M.The potential of stem cells for the restoration of auditory function in humans[J].Regenerative Medicine,2013,8 (3):309–318.

5 Oshima K,Shin K,Diensthuber M,et al.Mechanosensitive hair cell like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells [J].Cell,2010,141(4):704–716.

6 Chen W,Jongkamonwiwat N,Abbas L,et al.Restoration of audito?ry evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors [J].Nature,2012,490(7419):278–282.

7 Tang ZH,Chen JR,Zheng J,et al.Genetic correction of induced pluripotent stem cells from a deaf patient with MYO7A mutation results in morphologic and functional recovery of the derived haircell-like cells[J].Stem Cell Translation Medicine,2016,5(5): 561-571.

8 Chen JR,Tang ZH,Zheng J,et al.Effects of genetic correction on the differentiation of hair cell-like cells from iPSCs with MYO15A mutation[J].Cell Death and Differentiation,2016,23 (2016):1347-1357.

9 Mann ZF,Kelley MW.Development of tonotopy in the auditory pe?riphery[J].Hearing Research,2011,276(1):2–15.

10 Leonova EV.Raphael Y.Organization of cell junctions and cyto?skeleton in the reticular lamina in normal and ototoxically dam?aged organ of Corti[J].Hearing Research,1997,113(1):14-28.

11 Gulley RL,Reese TS.Intercellular junctions in the reticular lami?na of the organ of Corti[J].Journal of Neurocytology,1976,5(4): 479-507.

12 Forge A,Becker D,Casalotti S,et al.Gap Junctions in the inner ear:Comparison of distribution patterns in different vertebrates and assessement of connexin composition in mammals[J].Com?parative Neurology,2003,467(2):207-231.

13 Wan GQ,Corfas G,Stone JS.Inner ear supporting cells:Rethink?ing the silent majority[J].Seminars in Cell and Developmental Bi?ology,2013,24(5):448-459.

14 任麗麗.白化榮昌豬耳聾的分子病理機(jī)制研究.中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院,2013. Ren LL.Probing the molecular pathological mechanism underly?ing the deafness in albino Rongchang swine.Dissertation in Medi?cal School PLA,2013.

15 Ding J,Tang ZH,Chen JR,et al.Induction of differentiation of hu?man embryonic stem cells into functional hair-cell-like cells in the absence of stromal cells.Inter[J].The International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2016,81(A):208-222.

16 Fekete DM,Muthukumar S,Karagogeos D.Hair cells and support?ing cells share a common progenitor in the avian inner ear[J]. Journal of Neuroscience,1998,18(19):7811-7821.

17 Chen P,Segil N.p27(Kip1)links cell proliferation to morphogene?sis in the developing organ of Corti[J].Development,1999,126 (1):1581–1590.

18 Hildebrand MS,Dahl HH,Hardman J,et al.Survival of partially differentiated mouse embryonic stem cells in the scala media of the guinea pig cochlea[J].Journal of the Association for Research in Otolaryngology,2005,6(4):341–354.

19 Ito J,Kojima K,Kawaguchi S.Survival of neural stem cells in the cochlea[J].Acta Oto-Laryngologica,2001,121(2):140–142.

20 Li H,Roblin G,Liu H,et al.Generation of hair cells by stepwise differentiation of embryonic stem cells[J].Proceedings of the Na?tional Academy of Sciences of the United States of America,2003, 100(23):13495–13500.

21 Matsumoto M,Nakagawa T,Kojima K,et al.Potential of embryon? ic stem cell-derived neurons for synapse formation with auditory hair cells[J].Neuroscience Research,2008,86(14):3075–3085.

22 Altschuler RA,O’Shea KS,Miller JM,et al.Stem cell transplanta?tion for auditory nerve replacement[J].Hearing Research,2008, 242(1):110–116.

23 Coleman B,Hardman J,Coco A,et al.Fate of embryonic stem cells transplanted into the deafened mammalian cochlea[J].Cell Transplantation,2006,15(5):369–380.

24 Nishimura K,Nakagawa T,Ono K,et al.Transplantation of mouse induced pluripotent stem cells into the cochlea[J].NeuroReport, 2009,20(14):1250–1254.

25 Corrales CE,Pan L,Li H,et al.Engraftment and differentiation of embryonic stem cell–derived neural progenitor cells in the co?chlear nerve trunk:Growth of processes into the organ of corti[J]. Neurobiology,2006,66(13):1489–1500.

26 Jahnke,K.The fine structure of freeze-fractured intercellular junc?tions in the guinea pig inner ear[J].Acta Oto-Laryngologica, 1975,80(336):5-40.

27 Whitlon DS.E-cadherin in the mature and developing organ of Corti of the mouse[J].Journal of Neurocytology,1993,22(12): 1030-1038.

28 Furuse M,Hirase T,ItohM,et al.Occludin:a novel integral mem?brane protein localizing at tight junctions[J].The Journal of Cell Biology,1993,123(6):1777–1788.

29 Furuse M,Sasaki H,Tsukita S.Manner of interaction of heteroge?neous claudin species within and between tight junction strands [J].The Journal of Cell Biology,1999,147(4):891-903.

30 Itoh M,Nagafuchi A,Yonemura S,et al.The 220-kD protein colo?calizing with cadherins in non-epithelial cells is identical to ZO-1,a tight junction-associated protein in epithelial cells:cDNA cloning and immunoelectron microscopy[J].The Journal of Cell Biology,1993,121(3):491-502.

31 Itoh M,Morita K,Tsukita S.Characterization of ZO-2 as a MA?GUK family member associated with tight as well as adherens junctions with a binding affinity to occludin and alpha catenin[J]. Journal of Biological Chemistry,1999,274(9):5981-5986.

32 楊仕明.小型豬動物模型在耳科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].中華耳科學(xué)雜志.2016,14(1):1-5. Yang SM.The miniature pig as an animal model in otological re?search[J].Chinese Journal of Otology,2016,14(1):1-5.

33 Zhao LD,Li L,Wu N,et al.Migration and differentiation of mouse embryonic stem cells transplanted into mature cochlea of rats with aminoglycoside-induced hearing loss[J].Acta Oto-Laryngologi?cal,2013,133(2):136-143.

34 Shi Y,Su J,Roberts A,et al.How mesenchymal stem cells inter?act with tissue immune responses[J].Trends in Immunology, 2012,33(3):136-143.

Intercellular Junctions Between Hair Cell-like Cells and Supporting Cells Derived From Human iPSCs

WANG Cuicui1,CHEN Jianling1,TANG Zihua1,QIU Shiwei2,ZHANG Cui1,LI Liang1, GUO Weiwei2,YANG Shiming2,WANG Jinfu1
1 Institute of Cell and Development Biology,College of Life Sciences,Zijingang Campus,Zhejiang University, Hangzhou,Zhejiang 310058,P.R.China
2 Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853,China

WANG Jinfu Email:wjfu@zju.edu.cn

Obiective To examine the relationships between inner ear hair cells and supporting cells from induced pluripotent stem cells(iPSCs).Methods Normal iPSCs derived from a healthy donor(C-iPS),iPSCs with myosin7A mutation derived from a deaf patient(P-iPS)and iPSCs with myosin 7A corrected genetically(CP-iPS)were induced to differentiate into otic progenitors,and then OEPs were isolated from otic progenitors and induced to differentiate into inner ear hair cell-like cells and supporting cells.Immunofluorescence was used to examine in vitro formation of intercellular junctions between the induced hair cell-like cells and supporting cells.Furthermore,EGFP-OEPs derived from three iPSCs were transplanted into the inner ear of albino Rong-Chang swine via round widow to examine the migra-tion,differentiation and intercellular junctions between these cells.Results OEPs derived from iPSCs could be induced into hair cell-like cells and supporting cells simultaneously,and intercellular junctions such as adhering junctions and tight junctions were formed between hair cell-like cells and supporting cells derived from OEPs.After transplantation, the grafted cells could migrate from the scala tympani to the scala media.However,only a limited number of cells were integrated into the native auditory epithelial tissue,and some EGFP-cells integrated into the organ of Corti and expressed the hair cell marker MYO7A,indicating that these exogenous cells had differentiated into hair cell-like cells. Further immunolabeling assays showed production of adhering junction proteins(E-cadherin and N-cadherin)and a tight junction protein(ZO-1)between these differentiated cells and other cells,similar to what was observed in vitro. Conclusions Cell-cell interactions such as adhering junctions and tight junctions between hair cell-like cells and supporting cells derived from iPSCs can be formed not only in vitro but also in vivo.These results may facilitate the development of hair cells replacement-based strategy for deafness.

Deafness;IPSCs;Hair Cells;Supporting Cells;Intercellular Junctions

R764

A

1672-2922（2017）04-489-9

2017-06-21審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.04.020

國家重大基礎(chǔ)研究（973）項目，編號：2014CB541705

王翠翠，碩士，研究方向:干細(xì)胞治療感音神經(jīng)性耳聾的臨床基礎(chǔ)研究

王金福，Email:wjfu@zju.edu.cn