黃艷+陳雪云+楊雪峰

[摘要]目的 建立利伐沙班的有關物質測定方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsil C8（250 mm×4.6 mm，5 μm），以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（80∶20）為流動相A，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（10∶90）為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為250 nm。結果 利伐沙班與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間的分離度均>2.0，檢測限為0.2～0.5 ng，定量限為1.0～2.0 ng。結論 該方法適用于利伐沙班有關物質的測定。

[關鍵詞]高效液相色譜法；利伐沙班；有關物質；測定

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）08（c）-0078-04

[Abstract]Objective To establish a method to determine the related substance in Rivaroxaban.Methods HPLC method was used，column was Diamonsil C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase A was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，adjusted to pH 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （80∶20），the mobile phase B was treated with 5 mmol/L ammonium acetate solution （containing 0.3% 25% tetramethyl ammonium hydroxide solution，pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid）-acetonitrile （10：90），which was used as gradient elution The detection wavelength was 250 nm.Results The resolution of rivaroxaban and its related substance was above 2.0，detection limit was 0.2-0.5 ng，quantification limit was 1.0-2.0 ng.Conclusion The method is suitable for the determination of related substance in Rivaroxaban.

[Key words]HPLC；Rivaroxaban；Related substance；Determination

利伐沙班（Rivaroxaban）是一種Xa因子抑制劑，對Xa因子具有高度的選擇性[1-5]，于2008年在加拿大首先上市，用于髖或膝關節(jié)置換術后靜脈血栓栓塞癥的預防，有極好的體內活性和生物利用度，是可以口服的新型抗凝藥，具有良好的應用前景[6-13]。根據(jù)利伐沙班的合成工藝，可能存在的有關物質有乙酰草酰胺（雜質A）、二-草酰胺-尿素（雜質B）、脫氯化合物（雜質C）、氧代鄰苯二甲酰亞胺（雜質D）、4，5-二氯化合物（雜質E）、二胺（雜質F）和三胺（雜質G）等。為了保證藥品的安全性，現(xiàn)對自制的利伐沙班原料藥有關物質測定方法進行研究，建立了高效液相色譜法（HPLC）不加校正因子的主成分自身對照法測定利伐沙班的有關物質。該方法準確、簡便，能有效控制利伐沙班的質量。

1儀器與試藥

島津LC-2010AHT液相色譜儀，乙腈為色譜純，水為雙蒸水，乙酸銨、25%四甲基氫氧化銨、冰醋酸均為分析純，利伐沙班（自制，批號為20140801、20140901、20140902），利伐沙班對照品（MedChem Express，批號為03201），雜質A、B、C、D、F對照品均購自Cato Research Chemicals Inc，雜質E、G對照品均購自Quality Control Chemicals Inc。

2方法與結果

2.1溶液的配制

精密稱取利伐沙班適量，加溶劑[流動相A-流動相B（4∶1）]超聲溶解并稀釋制成每1毫升中約含0.4 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 ml，置50 ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 ml，置20 ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（80∶20）為流動相A，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.3%的25%四甲基氫氧化銨溶液，用冰醋酸調pH至4.8）-乙腈（10∶90）為流動相B，梯度洗脫（0～20 min，90% A；20～40 min，90% A→50% A；40～60 min，50% A；40～61 min，50% A→90% A；41～75 min，90% A）；檢測波長為250 nm；柱溫30℃；流速1.0 ml/min。分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并制成各對照品溶液及混合溶液；精密量取上述溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，混合溶液結果見圖1。理論塔板數(shù)按利伐沙班主峰計算為68 877，利伐沙班與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間的分離度均>2.0。endprint

2.3進樣精密度

取“2.2”項下的混合溶液20 μl注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次測定，結果各色譜峰面積的RSD均<2.0%（利伐沙班RSD=1.16%、雜質A RSD=0.52%、雜質B RSD=0.44%、雜質C RSD=0.36%、雜質D RSD=1.15%、雜質E RSD=0.67%、雜質F RSD=0.62%、雜質G RSD=0.39%），提示該方法的進樣精密度良好。

2.4專屬性試驗

精密稱取利伐沙班約20 mg，共6份，分別置50 ml量瓶中，按以下條件試驗：一份加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加0.3%的過氧化氫溶液2 ml，搖勻，室溫放置2 h，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，搖勻，室溫放置2 h，用1mol/L氫氧化鈉溶液2 ml中和，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，搖勻，室溫放置2 h，用1 mol/L鹽酸溶液2 ml中和，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份加溶劑適量，置沸水浴中加熱2 h，取出，放冷至室溫，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；一份于（4500±500）lx照射5 d，加溶劑超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述6種溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖2。

2.5檢測限和定量限

分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋制成每1毫升中約含利伐沙班5 μg的溶液，分別逐級稀釋，取20 μl注入液相色譜儀，經(jīng)分析，利伐沙班的檢測限為0.5 ng（S/N≈3）、定量限為2.0 ng（S/N≈10），雜質A的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質B的檢測限為0.2 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質C的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質D的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質E的檢測限為0.2 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質F的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10），雜質G的檢測限為0.3 ng（S/N≈3）、定量限為1.0 ng（S/N≈10）。

2.6線性關系試驗及校正因子的測定

分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋成每1 毫升中約含各組分1 μg的溶液，分別精密量取該溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0置10 ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（μg/ml）對峰面積作標準曲線，線性回歸方程、校正因子等結果見表1。校正因子的測定顯示，各雜質的校正因子均沒有超出0.9～1.1的范圍，可直接采用不加校正因子的主成分自身對照法進行限量檢查。

2.7溶液穩(wěn)定性試驗

取批號為20140901的供試品溶液，分別放置0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h后測定，結果主峰峰面積的RSD=0.76%，各雜質峰峰面積的RSD均<2.0%（雜質A RSD=1.06%、雜質B RSD=0.71%、雜質C RSD=0.64%、雜質D RSD=1.84%、雜質E RSD=1.62%、雜質F RSD=0.92%、雜質G RSD=1.23%、總雜質RSD=0.59%），提示供試品溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8供試品有關物質檢查

取3批供試品，按照“2.1”項下的方法制備溶液，按照“2.2”項下的色譜條件，采用不加校正因子的主成分自身對照法測定有關物質，結果見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇

分別精密稱取利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋制成每1毫升中約含各對照品10 μg的溶液，按照分光光度法[14-15]于190～400 nm波長范圍內掃描，利伐沙班及雜質A、B、C、D、E、F、G均在250 nm波長處有最大吸收，參照利伐沙班片進口注冊標準，將有關物質檢測波長確定為250 nm[16]。

3.2色譜條件優(yōu)化

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，將乙酸銨溶液與乙腈線下預先混合能改善基線漂移；另外，在流動相中加入四甲基氫氧化銨能有效地改善拖尾，提高分離度。

3.3專屬性試驗

利伐沙班在高溫、強光及氧化條件下雜質均無明顯變化，且未產(chǎn)生新的降解雜質；在強堿破壞條件下，雜質B、雜質C及相對保留時間0.714處有所增加，其他雜質均無明顯變化；酸破壞條件下，雜質C及相對保留時間0.714處未知雜質有所增加，其他雜質均無明顯變化，欲知此未知雜質具體是什么物質，還有待進一步研究。另外，通過安捷倫色譜工作站提供的“全波長法”分析以上色譜圖中，利伐沙班純度指數(shù)值均>0.990，提示主峰均為單一物質峰，且降解產(chǎn)物峰、已知雜質峰均與主峰的分離度滿足檢測要求。

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（收稿日期：2017-04-14 本文編輯：祁海文）endprint