富堯，張慧明，許龍，呂冬云*

(1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

·中藥工業(yè)·

地鱉蟲抗腫瘤成分提取方法的研究△

富堯1，張慧明2，許龍1，呂冬云1*

(1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：對(duì)地鱉蟲的脂類提取物的最佳提取方法進(jìn)行研究。方法：通過對(duì)索氏提取與超聲法的對(duì)比，對(duì)超聲時(shí)間、溫度、原料浸泡時(shí)間、有機(jī)溶劑的選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出最佳的脂類提取條件。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)通過單因素分析，得出超聲40 min時(shí)提取率為最高,達(dá)到17.23%，60 min時(shí)提取率反而下降為13.7%；超聲溫度在50 ℃時(shí)提取率最高，達(dá)到15.95%，隨后在溫度達(dá)到60 ℃時(shí)下降到14.02%,70 ℃時(shí)下降到10%以下；浸泡6 h時(shí)提取率最高，達(dá)到18.74%。而繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間12、24、48 h,對(duì)脂類的提取量沒有影響；有機(jī)溶劑無水乙醚提取率最高。結(jié)論：超聲法應(yīng)用無水乙醚浸泡6 h，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間40 min為地鱉蟲脂類物質(zhì)提取的最佳條件。

地鱉蟲；提取率；超聲波

地鱉蟲EupolyphagasinensisWalker屬顎亞門，六足總綱，有翅亞綱，蜚蠊目，鱉鐮科，地鱉亞科，地鱉屬?！侗静菥V目》：【釋名】地鱉(《本經(jīng)》)、土鱉(《別錄》)、蚵蟲(《綱目》)。《雷公炮制藥性解》：味咸，性寒，有毒，入心肝脾三經(jīng)。主留血壅瘀，心腹寒熱洗洗，祛堅(jiān)積癥瘕、下乳通經(jīng)?，F(xiàn)代藥學(xué)表明，其逐瘀、破積的功能對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著一定的抑制作用。地鱉蟲體內(nèi)的纖溶活性蛋白EPS72對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549有著體外抑制腫瘤的作用[1]，EFP蛋白對(duì)S180和H22實(shí)體瘤有一定的抑瘤作用，對(duì)H22和S180腹水瘤細(xì)胞端粒酶活性有一定降低作用，可提高Caspase-3表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。同時(shí)，地鱉蟲抗腫瘤有效脂溶性物質(zhì)在體外對(duì)消化道腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[3]。脂溶性物質(zhì)不溶于水，對(duì)這種脂溶性物質(zhì)的有效提取成為我們研究的方向。本實(shí)驗(yàn)對(duì)地鱉蟲脂類物質(zhì)提取的最佳方法進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

地鱉蟲粉末(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)，編號(hào)：121533)；無水乙醇、無水乙醚、正乙烷、丙酮(哈爾濱博士德生物有限公司，分析純)。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；電子精密天平JA5002(上海精天電子有限公司)；離心機(jī)(上海安亭公司)；DGX-9023鼓風(fēng)干燥箱(太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；索氏提取器(實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器)；1 L燒杯、大試管等。

1.2 方法

1.2.1 超聲法提取脂類物質(zhì) 取地鱉蟲粉末2 g放入大試管中，加入20 mL的有機(jī)溶劑浸泡，分別以浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲溫度、不同的溶劑為單一因素提取脂類物質(zhì)，濾出溶劑，剩下的殘?jiān)湃牒娓上?0 ℃，10 h烘干。烘干后稱重(確保固體物質(zhì)完全干燥)，計(jì)算提取率，見公式(1)。含有脂類的有機(jī)溶劑匯集到一起，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，提取脂類物質(zhì)。

脂類(%)=提取出脂類重量(g)/樣品重(g)×100%

(1)

1.2.2 單因素試驗(yàn) 分別以超聲時(shí)間、超聲溫度、粉末浸泡時(shí)間、不同溶劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，最終確定最佳提取工藝。見表1。

表1 單因素水平

1.2.3 不同溶劑對(duì)提取率的影響 脂類物質(zhì)不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，而且有機(jī)溶劑的種類不同，脂類的提取量也不相同。我們用無水乙醚、無水乙醇、正己烷、丙酮4種常用的脂類提取溶劑，用超聲法提取地鱉蟲的脂類物質(zhì)，超聲50 min，30 ℃浸泡6 h后提取，方法同上，烘干稱重計(jì)算提取率。

1.2.4 索氏提取與超聲提取法的比較 取5只試管，標(biāo)號(hào)，分別加入地鱉蟲粉末2 g，無水乙醚20 mL，浸泡6 h，30 ℃超聲50 min。殘?jiān)娓捎?jì)算提取率。同時(shí)取等量的粉末與無水乙醚，加入索氏提取器中進(jìn)行提取，殘?jiān)娓捎?jì)算提取率。將兩種方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 時(shí)間因素

超聲時(shí)間以60 min為上限，圖中可以看出隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，脂類提取率逐漸增大，呈拋物線趨勢(shì)，但是，并不是無限增大的，超聲40 min時(shí)提取率為最高，達(dá)到17.23%，60 min時(shí)提取率反而下降為13.7%。見圖1。

圖1 不同的超聲時(shí)間對(duì)脂類提取率的影響

2.2 溫度因素

超聲時(shí)的溫度對(duì)脂類的提取有著一定的影響，從圖中可看出隨著溫度的提高提取效率逐漸增大，超聲溫度在50 ℃時(shí)提取率最高，達(dá)到15.95%，隨后在溫度達(dá)到60 ℃時(shí)下降到14.02%，70 ℃時(shí)下降到10%以下，可見60 ℃是提取溫度的界限。見圖2。

圖2 不同超聲溫度對(duì)脂類提取率的影響

2.3 浸泡時(shí)間

傳統(tǒng)的脂類提取方法中，對(duì)提取物的浸泡是關(guān)鍵的步驟，通常要浸泡24 h以上，時(shí)間長(zhǎng)、效率低。而效率較高的超聲法提取脂類物質(zhì)對(duì)于提取物的浸泡時(shí)間也有著條件的限制。圖中隨著浸泡的時(shí)間延長(zhǎng)提取率逐漸增大，浸泡6 h時(shí)提取率最高，達(dá)到18.74%。而繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間(12、24、48 h)對(duì)脂類的提取量沒有影響。見圖3。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)脂類提取率影響

2.4 試劑因素

脂類物質(zhì)不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。我們選擇了4種常用的有機(jī)溶劑進(jìn)行脂類的提取，結(jié)果見圖4。提取率由高到低依次為無水乙醚>正己烷>丙酮>無水乙醇。

圖4 不同有機(jī)溶劑對(duì)脂類提取率的影響

2.5 提取方法的對(duì)比

索氏提取法為傳統(tǒng)的脂類提取方法，超聲法為新型的脂類提取方法。超聲法的提取率為18.74%，索氏提取法的提取率為14.78%，將二者進(jìn)行比較明顯可以看出超聲法用時(shí)短、提取率高，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。見圖5。

圖5 不同提取方法對(duì)脂類提取率的影響

3 結(jié)論

地鱉蟲中脂類物質(zhì)的提取最佳條件為超聲法，應(yīng)用超聲法提取時(shí)間為40 min、提取溫度為50 ℃，提取前浸泡6 h，浸泡于無水乙醚中。

4 討論

地鱉蟲作為傳統(tǒng)的中藥對(duì)腫瘤有著一定的抑制作用，目前對(duì)于其纖溶活性蛋白的研究有很多，地鱉蟲醇提取物(ESE)蛋白可以抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的增值，并促進(jìn)其凋亡[4]。地鱉蟲多肽F2-2具有降低血小板聚集率、延長(zhǎng)凝血啟動(dòng)時(shí)間、降低最大凝固程度以及增加大鼠離體血管環(huán)張力的作用[5]。目前對(duì)于地鱉蟲脂類的研究比較少，脂類物質(zhì)是油、脂肪、類脂的總稱。從地鱉蟲中提取有效的脂類物質(zhì)是目前研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)組對(duì)地鱉蟲脂類的提取及其對(duì)腫瘤的抑制作用進(jìn)行研究，以往的脂類提取方法是索氏提取法，其用時(shí)比較長(zhǎng)，條件限制比較嚴(yán)格。而超聲提取法是目前比較常用的脂類提取的新方法，我們將二者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在其他條件統(tǒng)一的情況下超聲法提取脂類物質(zhì)的提取率為18.74%，索氏提取法提取率為14.78%，見圖5。超聲波可以使組織中的各類物質(zhì)通過高頻振動(dòng)和空化作用，使大分子物質(zhì)分解成容易溶解的小分子物質(zhì)，有機(jī)溶劑可以溶解脂類物質(zhì)，從而提出。我們用超聲法分別對(duì)地鱉蟲粉末進(jìn)行脂類提取條件的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)單一條件下，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)提取效率逐漸增大，40 min為最高，達(dá)到17.23%，50 min時(shí)降到9.77%，60 min降到更低(見圖1)。超聲是利用高頻率的振動(dòng)使組織內(nèi)脂類快速滲出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)溫度會(huì)升高，過高的溫度會(huì)使脂類揮發(fā)，從而降低提取效率，所以在溫度條件的檢測(cè)中，最佳超聲溫度為50 ℃，此時(shí)提取率最大，見圖2，過高的超聲頻率會(huì)增加組織的溫度，導(dǎo)致脂類氧化分解，降低提取率。傳統(tǒng)的索氏提取需要浸泡提取物質(zhì)24 h以上，這樣可以很好地使有機(jī)溶劑與提取物質(zhì)相互融合，增大提取率，但是有機(jī)溶劑會(huì)揮發(fā)，長(zhǎng)時(shí)間的浸泡會(huì)使提取率降低。超聲法所需浸泡時(shí)間短，浸泡6 h的提取率達(dá)到18.74%，12 h反而下降到10.2%，雖然24 h時(shí)又升到了11.8%(見圖3)，但因耗時(shí)長(zhǎng)、提升效率低，不宜采納。脂類物質(zhì)不溶于水，溶于有機(jī)溶劑，我們采用的4種溶劑中無水乙醚的提取率最高，達(dá)到24.23%，最低為無水乙醇17.46%(見圖4)。本實(shí)驗(yàn)從脂類物質(zhì)中提取出粗提物，并作用于腫瘤細(xì)胞，同時(shí)觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。對(duì)于地鱉蟲脂類成分的分離，以及對(duì)其含量的鑒定將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

[1] 王鳳霞.中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis)抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究 [D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2013.

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StudyonExtractionofAntitumorConstituentsfromEupolyphagasinensis

FUYao1，ZHANGHuiming2，XULong1，LYUDongyun1*

(1.CollegeofLifeScience，JiamusiUniversity，Jiamusi154002，China；2.BasicMedicalSciences，Jiamusi154002，China)

Objective：To optimize the extraction of lipophile fraction ofEupolyphagasinensis.Methods：Through the comparison of Soxhlet extraction and ultrasonic extraction，the extraction conditions for the lipophile fraction were optimized with ultrasonic time，temperature，soaking time of raw material，organic solvent as the factors.Results:In this study, single factor analysis,The extraction rate was 17.23%, and the extraction rate decreased to 13.7% at 60 min；Ultrasonic temperature at 50 ℃ when the extraction rate of the highest, reaching 15.95%, then the temperature reached 60 ℃ to 14.02%. 70 ℃ down to 10% or less；The highest extraction rate was 18.74% when soaked for 6 h. While the prolonged soaking time 12h, 24h, 48h had no effect on the extraction of lipids；Organic solvent anhydrous ether extraction rate of the highest.Conclusion：The optimized condition was as follows：anhydrous ether soak 6 h，ultrasonic temperature 50，ultrasonic time 40 min.

EupolyphagasinensisWalker；extraction rate；ultrasonic

佳木斯大學(xué)學(xué)研究生創(chuàng)新課題(LZR2014_002)；佳木斯大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(JMSUJCMS2016-064)

] 呂冬云，教授，研究方向：應(yīng)用昆蟲；E-mail：lvdongyun1@eyou.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.018

2016-03-16)

*[