李麗娜 徐振宇 孔麗娜

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，蕪湖241001)

母-胎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在妊娠高血壓綜合征病理過程中的作用

李麗娜 徐振宇①孔麗娜

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，蕪湖241001)

目的：分析妊娠高血壓綜合征(PIH)患者外周血中免疫細(xì)胞因子水平變化及滋養(yǎng)層細(xì)胞中免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因、蛋白表達(dá)情況，探討母-胎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在妊娠高血壓綜合征病理過程中的作用。方法：納入PIH患者50例作為觀察組，選擇同期分娩的正常妊娠婦女40例作為對(duì)照組。ELISA法檢測(cè)兩組孕婦外周血中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分別測(cè)定兩組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3的mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：①觀察組外周血中IFN-γ和IL-17水平明顯高于對(duì)照組，TGF-β水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；兩組間IL-4水平無明顯差異(P>0.05)；觀察組IFN-γ/IL-4、IL-17/TGF-β比值均明顯大于對(duì)照組(P<0.05)。②與對(duì)照組比，觀察組T-bet、RORC的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，而GATA-3、Foxp3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，T-bet/GATA-3及RORC/Foxp3比值均顯著增大(P<0.05)。結(jié)論：PIH具有明顯的Th1/Th2及Th17/Treg比例失衡現(xiàn)象，其病理機(jī)制可能與Th細(xì)胞介導(dǎo)的母-胎免疫耐受機(jī)制功能紊亂有關(guān)。

妊娠高血壓綜合征；母-胎免疫耐受；滋養(yǎng)層細(xì)胞；細(xì)胞因子；轉(zhuǎn)錄因子

妊娠高血壓綜合征(Pregnancy-induced hypertension,PIH)簡稱妊高征，是目前產(chǎn)科常見的并發(fā)癥之一，也是妊娠期特有的疾病，包括妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期以及慢性高血壓合并妊娠[1]。PIH在健康產(chǎn)婦中的發(fā)生率為6%，在有妊高征病史的孕婦中甚至高達(dá)18%，嚴(yán)重危及母嬰健康[2]。因此，明確PIH發(fā)病機(jī)制并及早防治對(duì)保障孕產(chǎn)婦及胎兒生命安全具有重要意義。但目前關(guān)于PIH的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)有研究資料表明，PIH的發(fā)病與免疫因素有關(guān)，因母-胎免疫調(diào)節(jié)功能紊亂造成的妊娠失敗仍是目前難以克服的問題[3]。本研究通過分析PIH患者的免疫細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，探討其相關(guān)的母胎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在PIH病理過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象 選擇2015年1～12月于本院婦產(chǎn)科就診的PIH患者50例，作為對(duì)照組，年齡23～35歲，平均(29.8±3.9)歲；妊娠28～40周；其中PIH輕度16例、中度23例、重度11例。PIH的診斷及嚴(yán)重程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照2013年人民衛(wèi)生出版社出版的《婦產(chǎn)科學(xué)(第8版)》中推薦的標(biāo)準(zhǔn)[1]。排除妊娠前有心臟病、高血壓、腎病、糖尿病及抗磷脂綜合征等病史的患者。選擇同期在本院就診的正常健康妊娠婦女40例作為對(duì)照組，年齡24～37歲；平均(29.5±4.0)歲；妊娠28～40周。兩組均為初產(chǎn)婦，年齡、孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。

1.1.2主要儀器和試劑 主要儀器：低溫高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國BioTeke公司)，NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)。

主要試劑：肝素鈉(150 U/mg)、IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β ELISA檢測(cè)試劑盒(美國Invitrogen公司)；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液、DMEM(美國Gibco公司);青霉素-鏈霉素混合溶液(100×雙抗)、無菌PBS、胰蛋白酶(美國HyClone公司)；Percoll細(xì)胞分離液、HEPES(北京索萊寶科技有限公司)；DNaseⅠ膠原酶和抗體(美國Sigma公司)；總RNA提取試劑盒、DEPC、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；2×SYBR Green RT-qPCR 試劑盒(美國BioTeke公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3引物(上海生工生物有限公司合成)。其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1外周血細(xì)胞因子水平檢測(cè) 兩組孕婦均于入院后、產(chǎn)前采集外周靜脈血，肝素抗凝后3 000 r/min 離心15 min，分離出血漿，ELISA法檢測(cè)血漿中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β的水平。

1.2.2胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞獲取 ①分別取兩組中行剖宮產(chǎn)的孕婦術(shù)后的無菌胎盤組織，無菌條件下剪取蛻膜層與羊膜層之間的絨毛組織，以無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗凈后剪碎，用0.25%的胰蛋白酶+DNaseⅠ型膠原酶消化30 min后離心、棄去上清并收集細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM重懸，重復(fù)消化2次，共收集細(xì)胞3次。②將收集到的單細(xì)胞懸液用Percoll分離液進(jìn)行分離、純化，以含20%胎牛血清、1%雙抗和25 mmol/L HEPES的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀并置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3滋養(yǎng)層細(xì)胞總RNA提取及檢測(cè) 收集培養(yǎng)48 h后的滋養(yǎng)層細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞中總RNA；RNA定量后參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作；采用RT-qPCR法檢測(cè)T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3 mRNA表達(dá)；反應(yīng)程序：95℃2 min(變性)，95℃15 s(循環(huán)反應(yīng))，60℃15 s(40個(gè)循環(huán))，4℃保存。

1.2.4滋養(yǎng)層細(xì)胞總蛋白提取及檢測(cè) 收集培養(yǎng)48 h后的滋養(yǎng)層細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，100℃金屬浴5 min使蛋白變性；BCA法測(cè)定總蛋白濃度；Western blot法檢測(cè)T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1兩組外周血中免疫細(xì)胞因子水平分析 與對(duì)照組比較，觀察組孕婦外周血中IFN-γ和IL-17水平均明顯較高(P<0.05)，而TGF-β水平明顯較低(P<0.05)，IL-4水平有所降低但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組的IFN-γ/IL-4和IL-17/TGF-β比值均明顯大于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2兩組滋養(yǎng)層細(xì)胞中T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3mRNA表達(dá)水平分析 與對(duì)照組比，觀察組孕婦滋養(yǎng)層細(xì)胞中的T-bet、RORC mRNA表達(dá)水平均明顯較高(P<0.05)，而GATA-3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平均明顯較低(P<0.05)，但T-bet/GATA-3及RORC/Foxp3比值顯著增大(P<0.05)。見表2。

2.3兩組滋養(yǎng)層細(xì)胞中T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3蛋白表達(dá)水平分析 與對(duì)照組比，觀察組孕婦滋養(yǎng)層細(xì)胞中的T-bet、RORC蛋白表達(dá)水平均明顯較高(P<0.05)，而GATA-3、Foxp3蛋白表達(dá)水平均明顯較低(P<0.05)，T-bet/GATA-3及RORC/Foxp3比值顯著增大(P<0.05)。見圖1。

GroupsIFN-γ(ng/L)IL-4(ng/L)IL-17(ng/L)TGF-β(ng/L)IFN-γ/IL-4IL-17/TGF-βObservationgroup21.25±3.865.84±1.1518.62±2.685.22±0.843.92±1.163.46±0.72Controlgroup15.49±1.576.06±1.2810.55±1.439.64±1.572.71±0.651.14±0.18t8.615-1.65216.602-17.3895.88619.860P<0.0010.102<0.001<0.001<0.001<0.001

GroupsT-betGATA-3RORCFoxp3T-bet/GATA-3RORC/Foxp3Observationgroup5.24±1.331.01±0.203.26±0.811.14±0.395.52±1.832.95±1.23Controlgroup2.35±0.681.55±0.411.84±0.502.88±0.771.85±0.590.70±0.33t12.221-8.5688.591-15.06712.19611.242P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

圖1 兩組滋養(yǎng)層細(xì)胞中T-bet、GATA-3、RORC、Foxp3蛋白表達(dá)Fig.1 T-bet,GATA-3,RORC and Foxp3 protein levels of placenta cytotrophoblast in two groupsNote:Compared with the control group,*.P<0.05.

3 討論

母胎界面主要由來自母體的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜免疫細(xì)胞和來自胚胎的滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)成，是建立和維持妊娠的核心結(jié)構(gòu)[4]。正常妊娠可看作是一種成功的同種異體移植，攜帶父系抗原的胚胎不僅不被母體免疫系統(tǒng)排斥，還能與母體建立獨(dú)特的母-胎界面免疫耐受微環(huán)境，以維持成功妊娠，母-胎免疫耐受失調(diào)可導(dǎo)致子癇前期、自然流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局[5,6]。

母-胎免疫耐受機(jī)制中，Th細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答至關(guān)重要。在不同細(xì)胞因子的刺激下，由初始CD4+T細(xì)胞分化的Th0細(xì)胞進(jìn)一步分化為Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞，并發(fā)揮不同的生物學(xué)作用[7]。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，具有細(xì)胞毒性作用，能夠抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵并誘導(dǎo)其凋亡，并通過增強(qiáng)蛻膜巨噬細(xì)胞的活力來抑制胚胎植入，不利于妊娠的維持；Th2細(xì)胞與Th1相反，其分泌的細(xì)胞因子IL-4可刺激滋養(yǎng)層細(xì)胞生長和入侵，提高子宮容受性，對(duì)妊娠具有免疫營養(yǎng)和保護(hù)作用[8]。Th17細(xì)胞主要介導(dǎo)炎癥性疾病及自身免疫性疾病，其分泌的細(xì)胞因子IL-17可促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲并抑制其凋亡[9]。Treg細(xì)胞則通過分泌抑制性細(xì)胞因子如TGF-β，促進(jìn)CD4+CD25-T向CD4+CD25+Treg分化，形成母-胎界面的Treg優(yōu)勢(shì)，間接發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[10]。因此，正常生理妊娠時(shí)主要呈現(xiàn)輔助型T細(xì)胞2(Th2)型免疫優(yōu)勢(shì)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)擴(kuò)增現(xiàn)象，Th1/Th2和Th17/Treg平衡是維持正常妊娠的必備條件[4]。而另一方面，Th1/Th2和Th17/Treg平衡對(duì)母-胎免疫耐受具有維持作用[11,12]。故推測(cè)母-胎免疫耐受可能參與妊娠高血壓綜合征(PIH)等病理妊娠過程，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清晰。

本研究通過對(duì)比分析PIH患者與正常妊娠婦女外周血中免疫細(xì)胞因子水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠婦女相比，PIH患者外周血中IFN-γ和IL-17水平均明顯升高，TGF-β水平明顯降低，IL-4降低幅度不明顯，但I(xiàn)FN-γ/IL-4和IL-17/TGF-β比值均明顯增大，提示PIH患者存在Th1/Th2和Th17/Treg比例失衡，呈現(xiàn)Th2型及Treg免疫弱勢(shì)。當(dāng)Th1/Th2失衡時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生浸潤和增生障礙，導(dǎo)致胎盤發(fā)育不良，即可出現(xiàn)PIH等妊娠疾病。

為了進(jìn)一步探討PIH的發(fā)病機(jī)制，本研究從生物分子層面繼續(xù)探討母-胎免疫耐受機(jī)制在PIH病理過程中的作用。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORC及Foxp3分別是Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞相應(yīng)的特異轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控各類型Th細(xì)胞特征性細(xì)胞因子的表達(dá)[13]。T-bet/GATA-3和RORC/Foxp3比值的測(cè)定較其細(xì)胞因子水平測(cè)定更能客觀反映Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞的分化[14]。本研究RT-qPCR結(jié)果顯示，PIH患者的T-bet及RORC的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高，而GATA-3及Foxp3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯降低，因此PIH患者的T-bet/GATA-3和RORC/Foxp3比值顯著增大，呈明顯的Th2型及Treg免疫弱勢(shì)，與血細(xì)胞因子水平表達(dá)變化趨勢(shì)相一致。

綜上所述，妊娠婦女若存在明顯的Th1/Th2和Th17/Treg比例失衡則導(dǎo)致母-胎免疫耐受形成障礙，母體免疫排斥同種異體胎兒，引發(fā)PIH。因此PIH的發(fā)病可能與Th細(xì)胞介導(dǎo)的母-胎免疫耐受機(jī)制功能紊亂密切相關(guān)。

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[收稿2016-12-22 修回2017-01-15]

(編輯 張曉舟)

Effectoffetal-maternalimmunetoleranceonpregnancy-inducedhypertension

LILi-Na,XUZhen-Yu,KONGLi-Na.

DepartmentofObstetricsandGynecology,WannanMedicalCollegeYijishanHospital,Wuhu241001,China

Objective:To analyze the levels of immune cytokine in peripheral blood(PB) and the expressions of immune related transcription factors in placenta cytotrophoblast,which in patients with pregnancy-induced hypertension(PIH).And to explore the effect of fetal-maternal immune tolerance on pregnancy-induced hypertension.Methods:50 cases patients with PIH were selected as the observation group,and 40 healthy people were chosen as the control group.Enzyme-linked immunoassay(ELISA) was performed to detect the levels of IFN-γ,IL-4,IL-17 and TGF-β in peripheral blood.Quantitative Real-time PCR(RT-qPCR) and Western blot were used to analyze the mRNA expressions and protein levels of T-bet,GATA-3,RORC and Foxp3 in placenta cytotrophoblast,respectively.Results:①Compared with the control group,the IFN-γ and IL-17 levels in peripheral blood in the observation group were obviously higher and the TGF-β level was greatly lower(P<0.05).There was no significant difference of IL-4 level between the two groups(P>0.05),but the ratios of IFN-γ/ IL-4 and IL-17/TGF-β in the observation group were larger than that in the control group(P<0.05).②Compared with the control group,the mRNA expressios and protein levels of T-bet and RORC in the observation group were increased significantly(P<0.05),but that of GATA-3 and Foxp3 were decreased greatly(P<0.05).Thus,the ratios of T-bet/GATA-3 and RORC/Foxp3 in the observation group were significantly larger than that in the control group(P<0.05).Conclusion:PIH is occurred with the imbalance of Th1/Th2 and Th17/Treg,and it might be associated with the mechanism of fetal-maternal immune tolerance disorder that induced by Th cells.

Pregnancy-induced hypertension;Fetal-maternal immune tolerance;Placenta cytotrophoblast;Cytokines;Transcription factors

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.025

李麗娜(1976年-)，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事產(chǎn)科疾病及分子生物學(xué)方面的研究，E-mail：lilina765@163.com。

R714.2

A

1000-484X(2017)09-1398-04

①皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院藥劑科，蕪湖241001。