鄭博文 阮光洪 尼瑪此里 魯茸達(dá)瓦 瞿紅葉黃相中 李 冰 陳文雄 夏玉潔 鄧丹琪

綿頭雪蓮花提取物對UVA照射后人成纖維細(xì)胞增殖的影響

鄭博文1，6阮光洪1尼瑪此里2魯茸達(dá)瓦2瞿紅葉3黃相中4李 冰5陳文雄5夏玉潔5鄧丹琪6

目的： 明確綿頭雪蓮花提取物對UVA照射下的人成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用。方法： 制備綿頭雪蓮花浸膏，將培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞分為正常對照組、UVA照射組(10 J/cm2)及UVA+藥物組，CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性，并比較各組吸光度值。結(jié)果： UVA+藥物組漂浮死細(xì)胞(低于5%)少于UVA照射組(約20%～30%)；UVA+藥物組(200 μg/mL)吸光度值為1.16±0.22，高于UVA照射組的0.5±0.12，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 綿頭雪蓮花提取物對UVA照射人成纖維細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

綿頭雪蓮花； 紫外線； UVA; 人成纖維細(xì)胞

人的皮膚是一個把內(nèi)在器官和外部環(huán)境隔離的重要屏障[1]，人類皮膚老化的原因包括自然老化、壓力、環(huán)境和遺傳，但是最有害的因素是陽光(紫外線)和由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[1]。紫外線分為UVA(長波紫外線，波長320～400 nm)、UVB(中波紫外線，波長290～320 nm)、UVC(短波紫外線，波長100～290 nm)，但是幾乎全部的UVC和90%的UVB被大氣中的臭氧層吸收，能夠到達(dá)地面的UV主要為UVA和少量UVB[3-5]。雪蓮花是一種自古被中國藏族、維吾爾族廣泛使用的草藥，現(xiàn)代研究證明雪蓮花具有抗炎、抗輻射等藥物功效，而且以綿頭雪蓮花作用最強[6]。但是，雪蓮花是否有抗皮膚光老化、光損傷的作用目前尚未見相關(guān)研究報道。本研究旨在觀察綿頭雪蓮花提取物對紫外線照射后人成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 實驗動物 人成纖維細(xì)胞，購于中科院昆明動物所細(xì)胞庫。

1.2 測試物 綿頭雪蓮花植物全柱，由云南省迪慶州德欽縣人民醫(yī)院藏醫(yī)科協(xié)助收購；綿頭雪蓮花提取物(浸膏)，由云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室協(xié)助提取。

1.3 紫外線照射設(shè)備 SH-4A(UVA)，UVA型輻照劑，上海西格瑪高技術(shù)有限公司生產(chǎn)；自制紫外線照射儀高度調(diào)節(jié)架。

1.4 主要試劑 Gibco小牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基：賽默飛公司；0.25%胰蛋白酶：北京索萊寶公司；CCK8試劑盒：上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。

2 方法

2.1 人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞長到80%以上，狀態(tài)好活力高，視野基本無死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，顆粒無或很少。

2.1.2 棄培養(yǎng)液，加入2 mL PBS清洗細(xì)胞層，洗去殘余血清，棄PBS，再重復(fù)洗一次，并用巴氏吸管吸凈殘余的PBS，加入1 mL胰酶-EDTA消化，翻轉(zhuǎn)后，放入培養(yǎng)箱中大約2 min，然后水平搖晃使胰酶-EDTA覆蓋細(xì)胞層，在顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞消化情況(細(xì)胞圓縮，輕敲細(xì)胞瓶時細(xì)胞脫落即止)；加入2 mL新鮮培養(yǎng)基終止消化，將瓶底細(xì)胞吹打下來后，充分吹打細(xì)胞液，使其成為單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。

2.1.3 使用1000 rpm離心5 min，離心完畢后棄掉上清液，并加入6.5 mL新鮮培養(yǎng)基混懸。

2.1.4 吸取一定量新鮮培養(yǎng)基到干凈的加樣槽中，用排槍向調(diào)0孔和邊緣孔每孔加100 μL培養(yǎng)基，再吸取配好的細(xì)胞液到另外的加樣槽中，每個實驗孔加100 μL細(xì)胞液。

2.1.5 將種好的細(xì)胞板入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，37℃，5% CO2，培養(yǎng)過夜。

2.2 實驗條件摸索確立

2.2.1 雪蓮花提取物對人成纖維細(xì)胞細(xì)胞毒性試驗 取一塊完成種板的96孔，配制系列不同濃度雪蓮花提取物PBS溶液，每孔加入受試物20 μL詳見表1。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，37℃，5% CO2，培養(yǎng)18 h后，進(jìn)行cck8細(xì)胞活性檢測吸光度，并使用公式計算細(xì)胞活力=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] 。人成纖維細(xì)胞活力大于0.9的加藥組劑量作為后續(xù)正式檢測的雪蓮花高劑量組劑量。

測得吸光度計算細(xì)胞活力見表2，選擇200 μg/mL為正式實驗的高劑量組劑量。

2.2.2 紫外光細(xì)胞毒性試驗 在同一塊96孔，長波紫外線組距離紫外線燈5 cm，測得紫外線強度10 mw/cm2，測試組分別照射17、34、51、60 min， 以達(dá)到10 J/cm2、20 J/cm2、30 J/cm2、36 J/cm2的不同照射劑量；對照組及其余不照射的用錫箔紙遮蓋。照射后在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h后進(jìn)行CCK8檢測吸光度并依據(jù)上述公式計算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性在50%左右的照射劑量確定為正式實驗的照射劑量。

測得吸光度及計算細(xì)胞活力，見表3，選取10 J/cm2為正式實驗的照射劑量。

2.3 正式實驗分組及加藥 取一塊完成種板的96孔，配制系列高、中、低濃度的綿頭雪蓮花提取物-PBS溶液，每孔加入受試物20 μL見表4。

表1 各藥物濃度組和對照組加入藥物情況

注：空白調(diào)零孔為未接種細(xì)胞的空白孔，只加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基；正常對照為接種細(xì)胞不加任何干預(yù)因素的對照孔

表2 各藥物濃度組和對照組測得的平均吸光度數(shù)值及計算得到的細(xì)胞活力值

表3 各紫外線劑量組和對照組測得的平均吸光度值及計算得到的細(xì)胞活力值

表4 各實驗組加入藥物情況

2.4 紫外光照射 所有實驗組加藥物放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，除對照組外均用測定為10 mw/cm2強度紫外線劑量照射17 min，累計劑量大約為10 J/cm2，照射后在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

2.5 cck8細(xì)胞活性檢測 完成步驟4后，傾去96孔板培養(yǎng)液并拍干，配制含10% cck8檢測試劑的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所測得采用吸光度使用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，若各組數(shù)據(jù)均值呈正態(tài)分布且方差齊用ANOVA分析各組參數(shù)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 外觀形態(tài)改變 正常人成纖維細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞排列緊密，無或很少見漂浮死細(xì)胞(在全部細(xì)胞中所占比例低于1%)和顆粒(圖1)；UVA照射對照組人成纖維細(xì)胞經(jīng)過紫外線照射后細(xì)胞密度明顯降低，連接松散，呈橢圓形、長圓形，可見大量漂浮死細(xì)胞(在全部細(xì)胞中所占比例約20%～30%)和顆粒樣物(圖2)；加入各濃度梯度的綿頭雪蓮花提取物的成纖維細(xì)胞密度比UVA照射對照組明顯增高，仍有部分細(xì)胞變圓，局部連接松散，可見少量漂浮死細(xì)胞(在全部細(xì)胞中所占比例低于5%)和顆粒樣物(圖3)。

3.2 細(xì)胞活力改變 各組細(xì)胞測得吸光度見表5，從表中我們可以看到UVA照射對照組較正常對照組及綿頭雪蓮花各濃度組吸光度均明顯下降，應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行ANOVA分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.15,P<0.05)；正常對照組吸光度高于各劑量濃度組，但與高劑量組、中劑量組差異無顯著性(P>0.05)，與低劑量組差異有顯著性(P=0.02)；各劑量組從高到底，吸光度依次下降，但差異無顯著性(P>0.05)(圖4)。

圖1 正常組人成纖維細(xì)胞 圖2 UVA照射對照組人成纖維細(xì)胞 圖3 加藥組人成纖維細(xì)胞

圖4 各實驗組吸光度值比較情況

4 結(jié)論

從實驗結(jié)果我們可以看到，綿頭雪蓮花提取物對UVA照射人成纖維細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可以明顯減輕UVA照射所導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞活性降低。雖然各濃度組吸光度隨濃度提高相應(yīng)增加，但是統(tǒng)計學(xué)分析顯示并不具有顯著性差異。

5 討論

皮膚的主要功能是保護(hù)機體免受物理和化學(xué)因素的損害[7]，但是反復(fù)長期的紫外線照射可影響人皮膚的多種細(xì)胞成分和組織結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致皮膚緊致度降低、脆性增加、皺紋增多等多種老化表現(xiàn)，不斷累積的紫外線照射甚至皮膚癌的發(fā)生[5,8]。皮膚慢性紫外線損傷最具特征性的變化是真皮成分的改變UVA、UVB、UVC照射可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。MMP活化可以使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白發(fā)生降解作用，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是其抑制劑，二者的平衡參與了人皮膚的許多生理與病理過程[9]。MMP和TIMP的失衡最終導(dǎo)致皮膚松弛、皺紋的發(fā)生。同時，光老化的發(fā)生還和真皮內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平增高所導(dǎo)致的膠原蛋白和彈性蛋白降解、MAPK通路激活有密切關(guān)系[4,10]。其中UVA在紫外線的皮膚損害中扮演了最為重要的角色[10]。目前針對皮膚光老化的預(yù)防和治療方法，主要是外用防曬劑、抗氧化劑和抗光老化的護(hù)膚品，口服各種抗氧化劑和抗光老化的藥物等[11]。但總的來說，療效有限，而且許多抗光老化藥物諸如糖皮質(zhì)激素、羥氯喹、免疫抑制劑等均有程度不一的不良反應(yīng)，限制了其在臨床中的應(yīng)用。

雪蓮花別名又叫雪蓮、雪荷花、大木花等，屬菊科鳳毛菊屬植物。其記載最早見于藏藥文獻(xiàn)《月王藥珍》和清代《本草綱目拾遺》。雪蓮花常用的有綿頭雪蓮花、大苞雪蓮花 、水母雪蓮花等，主要生長于高海拔的寒冷地區(qū)。綿頭雪蓮花主要產(chǎn)于西藏、四川和云南的海拔4500米左右的高山巖石上、風(fēng)化的流沙處或巖石縫中，與水母雪蓮花等其他品種作為藏藥材同等入藥[12,13]。綿頭雪蓮花味甘 苦，溫性，在藏醫(yī)藥中主要用于補腎壯陽、調(diào)經(jīng)止血等，其功效具體表現(xiàn)為：消炎、止痛、抗炎、降低血壓、降血脂、 調(diào)經(jīng)止血、抗胃潰瘍、 醫(yī)治雪盲等。雪蓮具有藥理活性的化學(xué)成份主要是黃酮類、生物堿、內(nèi)酯、甾醇、多糖及揮發(fā)油等多種成分；其主要的次生代謝產(chǎn)物是黃酮及黃酮甙類化合物[12,14]。有研究表明雪蓮多糖和總黃酮含量高低直接影響到藥材質(zhì)量和臨床療效[15]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人工培植雪蓮花的總黃酮對炎癥大鼠模型有明顯的抗炎癥作用，其中低濃度的作用效果與氫化可的松對照組的作用效果相似。雪蓮花對炎癥早期出現(xiàn)的滲出、 水腫有明顯抑制作用[16,17]。也有實驗發(fā)現(xiàn)雪蓮花水提物的抗輻射損傷機制，其機制可能與清除氧自由基及防止染色體畸變有關(guān)[18-20]。張愛國等的研究發(fā)現(xiàn)雪蓮花醇提液能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性[21]。來自香港的一個最新對比實驗發(fā)現(xiàn)在綿頭雪蓮花、水母雪蓮花和新疆雪蓮花三個品種中，綿頭雪蓮花的抗炎治療效果最好[6]。

目前對雪蓮花的藥效學(xué)研究中主要集中于其抗炎、抗輻射研究，其抗紫外線損傷及光老化的研究尚未見報道。我們選擇雪蓮花品系中抗炎效果最好的綿頭雪蓮花來進(jìn)行抗光損傷和光老化的初步研究。實驗發(fā)現(xiàn)綿頭雪蓮花提取物有效提高了UVA照射下的人成纖維細(xì)胞的吸光度，說明和UVA照射對照組相比其能夠明顯提高受試細(xì)胞的細(xì)胞活力，且差異具有顯著性。雖然統(tǒng)計分析顯示差別不具有顯著性，但是隨加入綿頭雪蓮花提取物濃度增高，受試細(xì)胞的吸光度也有相應(yīng)提高。總之，本次實驗初步證明綿頭雪蓮花對人成纖維細(xì)胞的UVA損傷具有一定的保護(hù)作用。提示我們綿頭雪蓮花可能具有抗皮膚紫外線損傷及光老化的有效藥物成分，值得進(jìn)一步對綿頭雪蓮花有效成分提取、藥物活性分析及化學(xué)成分分析。

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(收稿：2017-04-06 修回：2017-05-15)

EffectsofSaussurealanicepsonhumanfibroblastsproliferationaffectedbyUVAirradiation

ZHENGBowen1,RUANGuanghong1,NIMacili2,LURongdawa2,QUHongye3,HUANGXiangzhong4,LIBing5,CHENGWenxiong5,XIAYujie5,DENGDangqi6.

1.DepartmentofDermatology,theSecondPeopleHospitalofYunnanProvince,theFourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650021,China; 2.DepartmentoftibetanMedicine,thePeopleHospitalofDeqinCounty,Diqing674500,China;3.DepartmentofOralRehabilitation,theDentalHospitalofYunnanProvince,Kunming650101,China; 4.KeyLaboratoryofChemistry,EthnicMedicinalResources,StateEthnicAffairsCommission&MinistryofEducation,SchoolofEthnicMedicine,YunnanMinzuUniversity,Kunming650504,China; 5.CenterforDrugSafetyEvaluation,KunmingInstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;6.DepartmentofDermatology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicaluniversity,Kunming650101,China

XIAYujie,E-mail:xiayujie@mail.kiz.ac.cnDENGDanqi,E-mail:danqid128@sina.com

Objective: To determine the protective effects of the extract from Saussurea laniceps on the proliferation of human fibroblasts induced by UVA.Methods: The extract from Saussurea laniceps was prepared and the cultured human fibroblasts were divided into normal control group, UVA group and UVA+ Saussurea laniceps group. The cell proliferation activity was detected by CCK8 and the OD of cells was detected.Results: Dead cells in UVA+ Saussurea laniceps group were less than 5%, which was less than that in UVA group (20%～30%). OD in UVA+ Saussurea laniceps group was 1.16±0.22, which was higher than that in UVA group (0.5±0.12), with a significant difference (P<0.05).Conclusion: The extract of Saussurea laniceps has protective effects on human fibroblasts proliferation induced by UVA.

saussurea laniceps; ultraviolet; UVA; human fibroblasts

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項資金項目(編號：2014FZ043)

1云南省第二人民醫(yī)院皮膚科，昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院皮膚科，云南昆明,650021 2德欽縣人民醫(yī)院藏醫(yī)科，云南迪慶,674500 3云南省口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，云南昆明,650101 4云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明,650504 5中國科學(xué)院昆明動物研究所，靈長類研究中心，昆明，650223 6昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，650101

夏玉潔，E-mail: xiayujie@mail.kiz.ac.cn 鄧丹琪，E-mail: danqid128@sina.com