羅敏 胡國(guó)清

作者單位：430030 武漢 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科

下調(diào)叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a促進(jìn)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移

羅敏 胡國(guó)清

作者單位：430030 武漢 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科

胡國(guó)清，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心二級(jí)教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師。兼任中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)鼻咽癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)常委，中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）委員，CSCO小細(xì)胞肺癌專(zhuān)家委員會(huì)委員，CSCO抗腫瘤藥物安全管理專(zhuān)家委員會(huì)委員，湖北省抗癌協(xié)會(huì)常委，湖北省鼻咽癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員，《中華放射腫瘤學(xué)雜志》編委等。曾留學(xué)德國(guó)，從事臨床腫瘤工作40年，有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，擅長(zhǎng)鼻咽癌等頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤、惡性淋巴瘤等腫瘤的放射治療及其綜合治療。承擔(dān)多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金及省重點(diǎn)科研項(xiàng)目；獲省市科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、三等獎(jiǎng)各1項(xiàng)。主編/副主編著作5部，主譯專(zhuān)著1部；發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇，近5年以第一作者及通信作者發(fā)表SCI論文17篇。

目的 探討下調(diào)叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a（FOXO3a）對(duì)促進(jìn)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法 慢病毒shRNA和空載病毒液Mock shRNA按復(fù)感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為50轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2和HNE1細(xì)胞，構(gòu)建低表達(dá)FOXO3a的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用Western blot、Real-time PCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)FOXO3a對(duì)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Twist和Snail的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白定位。Western blot和Real-time PCR檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建低表達(dá)FOXO3a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2和HNE1細(xì)胞。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞比較，低表達(dá)FOXO3a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而Vimentin、N-cadherin、Twist和Snail表達(dá)顯著升高，MMP2和MMP9表達(dá)亦升高。結(jié)論 下調(diào)FOXO3a可促進(jìn)鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

鼻咽腫瘤；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a；侵襲；轉(zhuǎn)移

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，放療是首選的治療手段。早期鼻咽癌單純放療后5年生存率達(dá)90%，而晚期鼻咽癌即使采用適形調(diào)強(qiáng)放療聯(lián)合化療綜合治療，仍有20%～30%的患者治療失?。?］。因此深入研究鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的內(nèi)在分子機(jī)制，尋找新的有效靶點(diǎn)，將成為提高鼻咽癌療效并改善患者生活質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)［2-3］。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3a（FOXO3a）是重要的抑癌基因，在多種腫瘤中被證實(shí)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）相關(guān)［4］，其表達(dá)被證實(shí)與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopro-teinases，MMPs）表達(dá)相關(guān)［5］。而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和MMPs的表達(dá)在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［6-7］。所以筆者推測(cè)下調(diào)FOXO3a可能促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HNE1購(gòu)自中南大學(xué)癌癥研究所。所有細(xì)胞系均用含10%胎牛血清的RPMI-1640（啟動(dòng)子生物科技）培養(yǎng)于在 37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hy-Clone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自杭州四季青公司，BCA蛋白定量試劑盒為海碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Twist和 Snail兔抗人單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，MMP9、MMP2兔抗人單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，慢病毒 FOXO3a shRNA1、FOXO3a shRNA2、FOXO3a shRNA3和空載病毒液Mock shRNA購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按9×104個(gè)/孔接種于12孔板中，12 h后按復(fù)感染指數(shù)（multi-plicity of infection，MOI）為 50分別加入下調(diào)FOXO3a（FOXO3a shRNA1、FOXO3a shRNA2、FOXO3a shRNA3）和對(duì)照空載病毒液（Mock shRNA），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染10 h后更換完全培養(yǎng)液，24 h后用含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，篩選轉(zhuǎn)染成功的鼻咽癌細(xì)胞，收集細(xì)胞，進(jìn)一步鑒定。

1.4 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)

收集各組細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按Green SYBR試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。FOXO3a上游引物：5'-CCCAACCAGCTCCTTTAACA-3'，下 游 引 物 ：5'-GAGTCCGAAGTGAGCAGGTC-3'；MMP9 上游引物：5'-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3'，下游引物：5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3'；MMP2 上 游 引 物 ：5'-TACGATGGAGGCGCTTG-3'，下 游 引 物 ：5'-TGCACTGCCAACTATTTGTC-3'；GAPDH 上 游 引 物 ：5'-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，下游引物：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 8 s，60 ℃32 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。

最后以2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

用RIPA細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞，裂解產(chǎn)物經(jīng)離心、蛋白變性后，加入Loading buffer上樣至SDSPAGE膠電泳分離，PVDF膜恒流電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉 1 h，Tween-PBS洗膜后加入一抗（E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Twist、Snail、MMP9 和 MMP2 兔抗），4℃過(guò)夜孵育，再次洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，Tween-PBS洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算各組條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別接種于24孔板中培養(yǎng)至95%融合，用10 μL無(wú)菌槍頭垂直劃出一條無(wú)細(xì)胞區(qū)，小心洗去漂浮細(xì)胞3遍后加入無(wú)血清培養(yǎng)液，放至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在劃痕0 h、24 h后于顯微鏡下觀察并拍照。各實(shí)驗(yàn)組24 h細(xì)胞遷移距離（mm）=0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度；24 h細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)于Transwell板上室面鋪ECM膠40 μL，5 h后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每毫升1×105個(gè)密度接種于上室，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液600 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再經(jīng)甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，用棉簽刮除上室面ECM膠，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（×200）觀察并拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

分別將下調(diào) FOXO3a（FOXO3a shRNA1、FOXO3a shRNA2、FOXO3a shRNA3）和對(duì)照空載（Mock shRNA）的4種慢病毒轉(zhuǎn)染鼻咽癌 CNE2和HNE1細(xì)胞，Western blot檢測(cè)各慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株中FOXO3a蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Mock shRNA未明顯影響 FOXO3a蛋白表達(dá)，而FOXO3a shRNA轉(zhuǎn)染可使FOXO3a蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，其中以FOXO3a shRNA3下調(diào)作用最顯著（圖1A）。Real-time PCR檢測(cè) FOXO3a mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，Mock shRNA不影響 FOXO3a mRNA表達(dá)，而其余3種 FOXO3a shRNA可明顯抑制 FOXO3a mRNA表達(dá)，其中以FOXO3a shRNA3的抑制作用最明顯，抑制率可達(dá)70%左右（圖1B）。因此，選取FOXO3a shRNA3和Mock shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以上表明本實(shí)驗(yàn)成功建立低表達(dá)FOXO3a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞。

圖1 低表達(dá)FOXO3a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞建立

2.2 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低表達(dá)FOXO3a鼻咽癌細(xì)胞CNE2-shRNA3和HNE1-shRNA3的劃痕愈合率分別為（80.23±7.10）%和（79.56±6.06）%，空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2-Mock shRNA和HNE1-Mock shRNA劃痕愈合率分別為（23.62±3.94）%和（20.83±5.34）%，低表達(dá)FOXO3a鼻咽癌細(xì)胞劃痕愈合率明顯高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞（P＜0.01），見(jiàn)圖2。說(shuō)明下調(diào)FOXO3a表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。

圖2 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力

2.3 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低表達(dá)FOXO3a鼻咽癌細(xì)胞CNE2-shRNA3和HNE1-shRNA3細(xì)胞穿過(guò)上室ECM膠及聚碳酸酯膜的數(shù)量分別為（105.33±18.50）個(gè)和（118.00±14.58）個(gè)，較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE2-Mock shRNA 的（45.00±9.57）個(gè)和 HNE1-Mock shRNA 的（40.67±7.21）個(gè)明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖 3?？梢?jiàn)下調(diào)FOXO3a后鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)。

圖3 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力

2.4 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)及定位

Western blot檢測(cè)下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌各細(xì)胞系中EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，低表達(dá)FOXO3a鼻咽癌細(xì)胞中上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin均較對(duì)應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)下調(diào)或缺失（P＜0.01），間質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin和N-cadherin表達(dá)較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞升高（P＜0.01），同時(shí)Twist和Snail表達(dá)亦上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖4A。利用熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白，熒光顯微鏡下觀察EMT標(biāo)志蛋白的細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)空載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞在細(xì)胞間隙可見(jiàn)黏附蛋白E-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜，低表達(dá)FOXO3a鼻咽癌細(xì)胞與細(xì)胞間E-cadherin表達(dá)缺失。同時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的骨架蛋白Vimentin較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)增加，均出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞樣改變，見(jiàn)圖4B。以上結(jié)果證實(shí)下調(diào)FOXO3a表達(dá)能誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞系獲得間質(zhì)細(xì)胞樣特性。

圖4 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)及定位

2.5 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)

Real-time PCR和Western blot檢測(cè)下調(diào)FOXO3a后鼻咽癌細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)情況，與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，低表達(dá)FOXO3a鼻咽癌細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 下調(diào)FOXO3a表達(dá)后MMP2和MMP9的表達(dá)

3 討論

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子（FOXO）是2000年被正式命名的一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、新陳代謝、凋亡以及調(diào)節(jié)免疫等方面起重要作用［8-10］。該家族包括多個(gè)成員，其中研究最多為FOXO3a［11］。FOXO3a 已在乳腺癌、胃癌、肺癌、腎透明細(xì)胞癌等［12-15］多種腫瘤中被證實(shí)與腫瘤的EMT相關(guān)。但目前FOXO3a在鼻咽癌中的研究較少，僅在鼻咽癌組織中被證明其表達(dá)與預(yù)后相關(guān)以及與腫瘤的EMT有關(guān)［16］。EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮樣表型，獲得間質(zhì)樣細(xì)胞特點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程，可介導(dǎo)惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［6，17］。MMPs是一個(gè)大家族，因其需要 Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用［18］，其中MMP9和MMP2已在我們前期研究中被證實(shí)與鼻咽癌侵襲相關(guān)［19］。因此我們推測(cè)下調(diào)FOXO3a可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT和上調(diào)MMP2與MMP9而促進(jìn)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究采用慢病毒作為有效載體，成功構(gòu)建低表達(dá)FOXO3a的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過(guò)特異性下調(diào)FOXO3a表達(dá)后，觀察下調(diào)FOXO3a基因在調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT、上調(diào)MMP2和MMP9和進(jìn)一步誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果顯示，下調(diào)的FOXO3a抑制了鼻咽癌細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin的表達(dá)升高，通過(guò)這一系列作用，最終促進(jìn)鼻咽癌上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。此外，MMPs是一類(lèi)鋅依賴(lài)的蛋白水解酶家族，其活化是誘導(dǎo)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要步驟。其家族成員MMP2和MMP9能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分—Ⅳ型膠原，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)FOXO3a表達(dá)后鼻咽癌細(xì)胞MMP2和MMP9蛋白表達(dá)升高，提示FOXO3a可能參與MMP2和MMP9的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，從而使鼻咽癌上皮細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，鼻咽癌細(xì)胞中FOXO3a基因?yàn)檎{(diào)控侵襲和遷移的重要因子之一，可能通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，上調(diào)MMP2和MMP9誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞獲得降解細(xì)胞外基質(zhì)并向遠(yuǎn)處運(yùn)動(dòng)的能力，最終促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移。然而在其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、上調(diào)MMP2和MMP9以及進(jìn)一步調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，具體通過(guò)何種信號(hào)通路和細(xì)胞因子協(xié)同作用，仍然有待進(jìn)一步探索。本研究為深入研究FOXO3a在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為針對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤治療提供了依據(jù)。

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［2017-05-17收稿］［2017-06-08修回］［編輯 羅惠予］

《中國(guó)癌癥防治雜志》執(zhí)行優(yōu)惠、獎(jiǎng)勵(lì)政策的啟事

為了更好、更快地進(jìn)行腫瘤學(xué)術(shù)交流和推廣科研成果的應(yīng)用，促進(jìn)我國(guó)腫瘤防治事業(yè)的繁榮和發(fā)展，本刊執(zhí)行優(yōu)惠、獎(jiǎng)勵(lì)政策：

1.所有來(lái)稿均免收審稿費(fèi)；

2.優(yōu)先3個(gè)月內(nèi)發(fā)表科研基金資助的論著；

3.凡屬?lài)?guó)家級(jí)、省部級(jí)重大項(xiàng)目的論著免收論文發(fā)表版面費(fèi)；

4.在讀研究生課題論著減免50%的版面費(fèi)；

5.凡發(fā)表國(guó)家級(jí)科研基金資助的論著獎(jiǎng)勵(lì)1 500元，發(fā)表省部級(jí)科研基金資助的論著獎(jiǎng)勵(lì)1 000元。

（本刊編輯部）

Silencing Forkhead Box Transcription Factor（FOXO3a）promotes tumor invasion and migration in nasopharyngeal carcinoma

Luo Min，Hu Guoqing
（Department of Oncology，Tongji Hospital，Tongji Medical CollegeAffiliated，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，P.R.China）

ObjectiveTo investigate whether Silencing Forkhead Box Transcription Factor（FOXO3a）can promote tumor invasion and migration in nasopharyngeal carcinoma（NPC）.MethodsThe NPC cell lines CNE2 and HNE1 were transfected with lentiviruses encoding short hairpin RNA（shRNA）targeting FOXO3a or encoding mock shRNA，and transfection efficiency was checked usingWestern blotting and real-time PCR.Scratch and transwell tests were performed to determine whether silencing FOXO3a induced invasion and migration of NPC cells.Western blotting was performed to identify changes in levels of the epithelial-mesenchymal transition markers E-cadherin，Vimentin，N-cadherin，Twist and Snail.Localization of these marker proteins was analyzed using immunofluorescence.Western blotting and real-time PCR were also used to measure expression of matrix metalloproteinases （MMPs）2 and 9.ResultsStably transfected cell lines were constructed in which FOXO3a was silenced.Silencing FOXO3a promoted tumor invasion and migration，based on the scratch and transwell tests.Levels of the epithelial marker E-cadherin were reduced.In contrast，levels of the mesenchymal markers vimentin and N-cadherin were increased，as were levels of MMP2 and MMP9.ConclusionSilencing FOXO3a may promote tumor invasion and migration in NPC.

Nasopharyngeal neoplasm；FOXO3a；Invasion；Migration

Hu Guoqing.E-mail：gqhu@tjh.tjmu.edu.cn

R739.63

A

1674-5671（2017）04-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272491，81572960）

胡國(guó)清。E-mail：gqhu@tjh.tjmu.edu.cn