CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞在肝細(xì)胞癌組織中的浸潤(rùn)及與預(yù)后的相關(guān)性研究

鐘鑒宏 向驍 覃宏貴 游雪梅 馬良 吳飛翔 向邦德 袁衛(wèi)平 黎樂群，3

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心；3區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

臨床研究

CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞在肝細(xì)胞癌組織中的浸潤(rùn)及與預(yù)后的相關(guān)性研究

鐘鑒宏1，2向驍1，2覃宏貴1，2游雪梅1，2馬良1，2吳飛翔1，2向邦德1，2袁衛(wèi)平1，2黎樂群1，2，3

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心；3區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的檢測(cè)CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組織中的浸潤(rùn)程度，并分析其與預(yù)后的相關(guān)性。方法收集行肝切除術(shù)的HCC患者215例，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞在HCC癌組織中的浸潤(rùn)程度，根據(jù)浸潤(rùn)情況比較患者肝切除術(shù)后無瘤生存率和總生存率。結(jié)果CD4+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)和低浸潤(rùn)比例分別為60.9%和39.1%。CD4+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者總生存率和無瘤生存率均顯著高于低浸潤(rùn)組（P=0.015，P=0.038）。CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)和低浸潤(rùn)比例分別為34.9%和65.1%。CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者的總生存率和無瘤生存率亦顯著高于低浸潤(rùn)組患者（P=0.033，P=0.047）。結(jié)論CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞低浸潤(rùn)可能與HCC患者術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)。

肝腫瘤；CD4+T淋巴細(xì)胞；CD8+T淋巴細(xì)胞；總生存率；預(yù)后

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）惡性程度高，預(yù)后較差［1-2］。復(fù)發(fā)是HCC患者術(shù)后死亡的主要原因［3］。因此，尋找影響HCC復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素有重要意義。癌灶和癌旁的適應(yīng)性免疫細(xì)胞參與形成腫瘤免疫微環(huán)境。有研究顯示，T細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞（如CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞）浸潤(rùn)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率和總生存率相關(guān)［4］，癌組織CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)的患者預(yù)后更佳［4-5］。但在HCC研究領(lǐng)域，此類研究報(bào)道較少。本研究收集接受肝切除術(shù)HCC患者的臨床資料，采用免疫組化法分析癌組織中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)水平，探討其與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料

收集2011年1月至2013年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院首次行肝切除術(shù)治療的HCC患者資料［6］，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴癌和癌旁蠟塊匹配于同一患者；⑵臨床病理基線資料完整；⑶術(shù)后至少有一次隨訪記錄；⑷術(shù)前未接受針對(duì) HCC治療；⑸HBsAg（+）。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴復(fù)發(fā)性HCC；⑵HCV抗體（+）。HCC術(shù)后或腫瘤復(fù)發(fā)后采取的任何治療方式不影響本研究的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過，所有患者知情同意。

1.2 免疫組化方法和判定標(biāo)準(zhǔn)

10%濃度甲醛固定標(biāo)本，石蠟常規(guī)包埋。免疫組化實(shí)驗(yàn)方法詳見文獻(xiàn)［7］。參考文獻(xiàn)［8］，并根據(jù)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞受體蛋白染色強(qiáng)度范圍的不同進(jìn)行評(píng)分：從低浸潤(rùn)到高浸潤(rùn)分為score 0+、score 1+、score 2+和score 3+。score 0+和score 1+歸為低浸潤(rùn)；score 2+和score 3+歸為高浸潤(rùn)。細(xì)胞β連環(huán)蛋白表達(dá)小于10%表示1+、10%～50%表示2+、>50%表示3+。

1.3 觀察指標(biāo)

肝切除術(shù)操作方法詳見文獻(xiàn)［9-10］，圍手術(shù)管理如文獻(xiàn)［11］描述。患者出院后每3個(gè)月電話隨訪1次，內(nèi)容包括患者一般情況、出院后治療情況（包括到其他醫(yī)院進(jìn)行治療）、疾病復(fù)發(fā)與否等。術(shù)后定期復(fù)查甲胎蛋白、乙肝兩對(duì)半、血常規(guī)、肝功能、腎功能、凝血酶原時(shí)間、胸部X線、腹部B超、腹部CT或MRI，復(fù)查頻率遵循我國(guó)HCC診療規(guī)范——《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》［12］。隨訪終點(diǎn)包括因HCC復(fù)發(fā)或相關(guān)并發(fā)癥死亡，隨訪截至2016年8月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）M（QR）描述。分類變量率或構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。生存率用Kaplan-Meier法估計(jì)，組間差異比較行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入情況

2011年1 月至2013年6月我院共實(shí)施肝切除術(shù)686例，其中混合型肝癌18例，肝內(nèi)膽管癌13例，肝肉瘤和肝腺瘤各2例；接受多次肝切除術(shù)34例；術(shù)前接受針對(duì)HCC治療（經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞或放療）32例，術(shù)后無隨訪記錄85例，HCV抗體（+）3例；癌和癌旁石蠟缺失12例；癌或癌旁石蠟缺失（即資料不完整）270例。最終215例符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 納入研究患者一般特點(diǎn)和預(yù)后分析

納入研究的215例HCC患者中，男性191例，女性24例；年齡≥60歲78例，<60歲137例，中位年齡46歲（19～71歲）；67.9%患者合并肝硬化，93%的患者肝功能Child-Pugh A級(jí)；根據(jù)巴塞羅那臨床肝癌分期（Barcelona clinical liver cancer，BCLC）0/A 期占60%，B期占19%，C期占21%；其他基線資料見表1。截至2016年8月，共87例患者死亡，中位生存期為51個(gè)月，1年、2年、3年、4年累積總生存率分別為92%、82%、73%、50%（圖1A）；174例患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，中位無瘤生存期為24個(gè)月，1年、2年、3年、4年累積無瘤生存率分別為66%、47%、26%、15%（圖1B）。

2.3 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

215 例HCC癌組織免疫組化結(jié)果分析顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)和低浸潤(rùn)的比例分別為60.9%和39.1%，免疫組化結(jié)果見圖2。CD4+T淋巴細(xì)胞低浸潤(rùn)與大腫瘤、微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、術(shù)前甲胎蛋白≥400 ng/mL、術(shù)后1個(gè)月甲胎蛋白≥400 ng/mL、Edmondson-Steiner分級(jí)Ⅲ/Ⅳ級(jí)、BCLC-C期和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。見表1。

在總生存率方面，CD4+T淋巴細(xì)胞低浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)比為1.782（95%CI 1.121～2.833）；無瘤生存率CD4+T淋巴細(xì)胞低浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)比為1.399（95%CI 1.018～1.921）。CD4+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者總生存率和無瘤生存率均顯著高于低浸潤(rùn)組（P=0.015，P=0.038）。見圖3。

表1 HCC癌組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系（n）

（續(xù)表）

圖1 215例HCC患者的總生存和無瘤生存曲線

圖2 CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞在HCC癌組織中的浸潤(rùn)（×400）

圖3 CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與總生存率和無瘤生存率的關(guān)系

CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)和低浸潤(rùn)的比例分別為34.9%和65.1%，免疫組化結(jié)果見圖2。CD8+T淋巴細(xì)胞低浸潤(rùn)與多結(jié)節(jié)、腫瘤包膜不完整、術(shù)前甲胎蛋白≥400 ng/mL、術(shù)后1個(gè)月甲胎蛋白≥400 ng/mL、Edmondson-Steiner分級(jí)Ⅲ/Ⅳ級(jí)以及腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)（表1）。在總生存率方面，CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)比為1.591（95%CI 1.039～2.437）；無瘤生存率CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)比為1.371（95%CI 1.004～1.872）。CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者總生存率和無瘤生存率均顯著高于低浸潤(rùn)組患者（P=0.033，P=0.047）。見圖4。

2.4 單因素和多因素分析預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素

單因素分析顯示，腫瘤直徑≥5cm、多結(jié)節(jié)、肝硬化、微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、術(shù)前甲胎蛋白≥400 ng/mL、術(shù)后1個(gè)月甲胎蛋白≥400 ng/mL、Edmondson-Steiner分級(jí)Ⅲ/Ⅳ級(jí)、BCLC-C期腫瘤可能是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)可能是患者預(yù)后的保護(hù)因素。在無瘤生存率方面，腫瘤直徑≥5 cm、多結(jié)節(jié)、微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、術(shù)前甲胎蛋白≥400 ng/mL、術(shù)后1個(gè)月甲胎蛋白≥ 400 ng/mL、BCLC-C期腫瘤可能是患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)可能是腫瘤復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。

多因素分析顯示，腫瘤直徑≥5 cm、多結(jié)節(jié)、微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、術(shù)前甲胎蛋白≥400 ng/mL、術(shù)后1個(gè)月甲胎蛋白≥400 ng/mL、Edmondson-Steiner分級(jí)Ⅲ/Ⅳ、BCLC-C期腫瘤和腫瘤復(fù)發(fā)是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)是患者預(yù)后的保護(hù)因素（表2）。在無瘤生存率方面，腫瘤直徑≥5 cm、多結(jié)節(jié)、微血管侵犯、腫瘤包膜不完整、術(shù)前甲胎蛋白≥400 ng/mL、術(shù)后1個(gè)月甲胎蛋白≥400 ng/mL、BCLC-C期腫瘤是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)是腫瘤復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。見表2。

圖4 CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與總生存率和無瘤生存率的關(guān)系

表2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析HCC患者總生存率和無瘤生存率

3 討論

肝切除術(shù)是早期HCC的首選治療方式，但總體效果欠佳，可能與患者機(jī)體免疫系統(tǒng)抗腫瘤免疫缺陷有關(guān)。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+通過調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)也可抑制抗腫瘤免疫，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視［13］。本研究分析215例HCC患者癌組織中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與患者臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞低浸潤(rùn)與多個(gè)不良預(yù)后因素相關(guān)，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者的總生存率和無瘤生存率均顯著高于低浸潤(rùn)組患者，多因素分析發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)是腫瘤復(fù)發(fā)和患者預(yù)后的保護(hù)因素，與Gabrielson等［14］報(bào)道結(jié)果一致。

CD8+T淋巴細(xì)胞與非特異性自然殺傷細(xì)胞等共同承擔(dān)著腫瘤的免疫監(jiān)視作用，具有對(duì)腫瘤細(xì)胞直接殺傷功能。在本研究中，HCC組織中CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者總生存率和無瘤生存率均顯著高于低浸潤(rùn)組患者。Gabrielson等［14］研究發(fā)現(xiàn)，無論是HCC組織還是癌旁組織的CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)均與更低的腫瘤復(fù)發(fā)率相關(guān)。Gao等［15］一項(xiàng)納入302例HCC的研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中CD4+T淋巴細(xì)胞或CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組患者的無瘤生存率和總生存率均稍高于低浸潤(rùn)組患者，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大量研究證實(shí)，HCC組織中FoxP3+Tregs細(xì)胞高浸潤(rùn)與患者無瘤生存率和總生存率呈負(fù)相關(guān)，一致認(rèn)為FoxP3+Tregs細(xì)胞促進(jìn)HCC疾病進(jìn)展與通過抑制CD8+T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能有關(guān)［15-17］。

另一方面，PD-L1分子高表達(dá)是T細(xì)胞耗竭的重要標(biāo)記，與T細(xì)胞激活和功能呈負(fù)相關(guān)［18］。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，PD-L1在HCC細(xì)胞中可導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡，且干擾素介導(dǎo)上調(diào)PD-L1表達(dá)后T細(xì)胞凋亡更加明顯；而使用PD-L1抑制劑后，T細(xì)胞凋亡則明顯下降［19］。另外，在PD-L1敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PD-L1在肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞激活和失活方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［20］。上述研究說明，PD-1/PD-L1表達(dá)與CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)存在一定拮抗或協(xié)同作用?？筆D-1/PD-L1治療可能通過上調(diào)CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量或恢復(fù)其功能而發(fā)揮抗腫瘤增殖的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，HCC癌組織中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)與多個(gè)臨床病理因素相關(guān)，CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)是HCC患者預(yù)后的保護(hù)因素。

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［2017-02-24收稿］［2017-03-28修回］［編輯 羅惠予］

Expression and prognostic significance of CD4+/CD8+T lymphocytes in patients with hepatocellular carcinoma

Zhong Jianhong1，2，Xiang Xiao1，2，Qin Honggui1，2，You Xuemei1，2，Ma Liang1，2，Wu Feixiang1，2，Xiang Bangde1，2，Yuan Weiping1，2，Li Lequn1，2，3
（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Guangxi Liver Cancer Diagnosis and Treatment Engineering and Technology Research Center；3Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Early Prevention and Treatment，Ministry of Education，Nanning 530021，P.R.China）

ObjectiveTo clarify the relationship between infiltration by CD4+/CD8+T lymphocytes and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma（HCC）.MethodsA total of 215 HCC patients who underwent hepatectomy were examined by immunohistochemistry to detect infiltration of CD4+/CD8+T lymphocytes in tumor tissues.Disease-free survival and overall survival were compared between patients with or without such infiltration.ResultsOf all patients，60.9%showed high CD4+T lymphocyte infiltration，while the remaining 39.1%showed low infiltration.Rates of disease-free survival and overall survival were significantly higher among patients with high infiltration than among patients with low infiltration （P=0.038 and 0.015，respectively）.Of all patients，34.9%showed high CD8+T lymphocyte infiltration and 65.1%showed low infiltration.Rates of disease-free survival and overall survival were significantly higher among patients with high infiltration than among patients with low infiltration （P=0.047 and 0.033，respectively）.ConclusionLow infiltration of CD4+or CD8+T lymphocytes into tumors may relate to poor prognosis of HCC patients.

Liver neoplasms；CD4+T lymphocytes；CD8+T lymphocytes；Overall survival；Prognosis

Li Lequn.E-mail：Li_lequn@263.net

R735.7

A

1674-5671（2017）04-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.13

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題資助項(xiàng)目（2012ZX10002010001009）；廣西衛(wèi)計(jì)委科研課題資助項(xiàng)目（Z2016512，GZZC15-34，Z2015621，Z2014241）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（桂科攻14124003-4）；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（YCBZ2015030）

黎樂群。E-mail：Li_lequn@263.net