HBx和HSF1對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長的影響

張智 郭鵬 孫興 肖藝 徐靜 彭濤 趙國良 吳曙粵 黃海

作者單位：530022 南寧 1南寧市第一人民醫(yī)院肝膽胰腺外科；530021 南寧 2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔外科；530021 南寧 3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科；530022 南寧 4南寧市第一人民醫(yī)院兒科

Zhang Zhi1，Guo Peng2，Sun Xing1，Xiao Yi1，Xu Jing3，Peng Tao3，Zhao Guoliang3，Wu Shuyue4，Huang Hai1

（1Department of Hepatobiliary and pancreas Surgery,the First People's Hospital of Nanning，Nanning 530022，P.R.China；2Department of the Dental Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；3Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；4Department of Pediatrics，the First People's Hospital of Nannin，Nanning 530022，P.R.China）

基礎(chǔ)研究

HBx和HSF1對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長的影響

張智1郭鵬2孫興1肖藝1徐靜3彭濤3趙國良3吳曙粵4黃海1

作者單位：530022 南寧1南寧市第一人民醫(yī)院肝膽胰腺外科；530021 南寧2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔外科；530021 南寧3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科；530022 南寧4南寧市第一人民醫(yī)院兒科

目的探討過表達(dá)乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B virus X gene，HBx）上調(diào)熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長的影響。方法通過pcDNA3.1載體與HBx基因連接構(gòu)建pcDNA3.1-HBx過表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建空載體pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，獲得Mock/HepG2細(xì)胞（對(duì)照組）和HBx/HepG2細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）。采用Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)HSF1和HBx蛋白表達(dá)水平，MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長情況。結(jié)果與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的Mock/HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx的HBx/HepG2細(xì)胞中HBx和HSF1蛋白表達(dá)明顯增加；細(xì)胞平板克隆形成［（46.13±1.25%vs 86.43±1.01%）］、侵襲能力［（22.47±2.05）%vs（51.01±1.75）%］和遷移能力［（24.18±0.98）%vs（59.03±0.83）%］明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論HBx基因可上調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞HSF1和HBx蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，導(dǎo)致細(xì)胞惡性生長。

肝腫瘤；乙型肝炎病毒X基因；熱休克轉(zhuǎn)錄因子1；肝癌HepG2細(xì)胞；細(xì)胞生長

肝癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、病死率高，預(yù)后較差［1］。即使早期手術(shù)切除小肝癌，5年內(nèi)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍高達(dá)50%［2］。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染是促進(jìn)肝癌形成的主要因素。研究表明，乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B virus X gene，HBx）的表達(dá)產(chǎn)物一方面參與病毒自身的復(fù)制過程，另一方面通過直接或間接的蛋白質(zhì)之間的相互作用影響宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等多種生物學(xué)過程，從而促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展［3］。研究表明，熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）基因是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝╤eat shock protein，HSP）表達(dá)的重要因子，調(diào)控多種基因的表達(dá)［4］，與肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5］。

本研究通過瞬轉(zhuǎn)法構(gòu)建HBx過表達(dá)HepG2肝癌細(xì)胞，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測HSF1和HBx兩種蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平，MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長情況，探討HSF1和HBx相互作用對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響，以期為臨床肝癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。特異性HBx抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人HSF1抗體、β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司，Matrigel購自美國BD公司，脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）購自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國Millipore公司，ECL顯色劑購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，MTT試劑盒和BCA蛋白試劑盒購自中國碧云天生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2一定飽和濕度環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 載體構(gòu)建和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞

設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)引物，擴(kuò)增并獲得全長HBx基因片段，經(jīng)酶切和連接反應(yīng)插入pcDNA3.1載體，構(gòu)建過表達(dá)HBx的pcDNA3.1-HBx載體。試劑盒提取質(zhì)粒，行雙酶切和電泳鑒定測序。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將過表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx和空載體pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，獲得Mock/HepG2細(xì)胞（對(duì)照組）和HBx/HepG2細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測HSF1和HBx蛋白的表達(dá)

常規(guī)培養(yǎng)Mock/HepG2細(xì)胞和HBx/HepG2細(xì)胞，待密度長至85%～95%，胰酶消化細(xì)胞，用1×PBS洗滌，3 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞。加入50 μL細(xì)胞裂解液和0.2 μL PMSF，冰上裂解30 min。4℃12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。根據(jù)測得濃度，每孔上樣25 g蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min。上樣至10%SDS-PAGE凝膠，80V電泳30 min，轉(zhuǎn)120V電泳90 min，取出凝膠于4℃轉(zhuǎn)印2 h至PVDF膜；5%牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，加入HBx或者HSF1抗體（1∶1000），4℃孵育過夜，1×PBST漂洗PVDF膜3次，每次5 min，加入鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育 2 h，1×PBST 漂洗PVDF膜3次，每次5 min，DAB顯色法顯色并掃描成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

常規(guī)培養(yǎng)Mock/HepG2細(xì)胞和HBx/HepG2細(xì)胞，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞分別按1×104個(gè)/孔接種于5塊96孔板中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，每24 h取一塊96孔板行MTT實(shí)驗(yàn)檢測。每孔加入10 mL MTT溶液（濃度5 mg/mL），培養(yǎng)箱孵育4 h，加入DMSO溶液150 μL/孔，水平搖床上孵育10 min。酶標(biāo)儀取490 nm處測定各孔OD值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)孔值-空白孔值）/（對(duì)照孔值-空白孔A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

取對(duì)數(shù)生長期的Mock/HepG2和HBx/HepG2細(xì)胞，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液；取200個(gè)細(xì)胞分別接種于含10 mL、10%FBS的DMEM皿中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。棄上清液，PBS洗去殘留血清和培養(yǎng)基。加入5 mL甲醇固定細(xì)胞5min。去固定液，加適量0.005%龍膽紫染色10 min，流水緩慢漂洗染色液，空氣干燥。顯微鏡計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

直尺和Marker筆用紫外線照射30 min。Marker筆在12孔板背后用直尺每隔0.5 cm劃橫線穿過培養(yǎng)孔，每孔5條。常規(guī)培養(yǎng)Mock/HepG2細(xì)胞和HBx/HepG2細(xì)胞，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按5×104個(gè)/孔接種于12孔板中。約24 h細(xì)胞長滿后，用20 μL無菌槍頭比著直尺，垂直于橫線劃痕。用1×PBS洗凈劃痕處殘留細(xì)胞，加入無血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

Matrigel基底膜加入無血清DMEM，按1∶8稀釋，取100 μL稀釋液包被Transwell小室的上室，4℃孵育1 h。取出小室，吸棄培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50 μL無血清DMEM，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min。用胰酶消化Mock/HepG2細(xì)胞和HBx/HepG2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105。Transwell上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入 500 μL含 0.2%FBS的DMEM。置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄除DMEM培養(yǎng)基，用1×PBS洗去殘留培養(yǎng)基，甲醇固定5 min，加入0.1%結(jié)晶紫染色5 min，水沖洗干凈。隨機(jī)選取5～8個(gè)視野，通過Leica DC 300F倒置顯微鏡觀察和拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布資料的兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBx和HSF1蛋白在Mock/HepG2和HBx/HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體的HBx/HepG2細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）HBx和HSF1蛋白表達(dá)量增加，而轉(zhuǎn)染空載體的Mock/HepG2細(xì)胞（對(duì)照組）中未見HBx蛋白表達(dá)，僅見少量HSF1蛋白表達(dá)。說明pcDNA3.1-HBx載體成功轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細(xì)胞中，目的基因HBx在細(xì)胞中成功表達(dá)，且促進(jìn)了HBx和HSF1蛋白表達(dá)。見圖1。

2.2 細(xì)胞生長情況

細(xì)胞生長曲線顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體的HBx/HepG2細(xì)胞第3天細(xì)胞開始生長，速度較轉(zhuǎn)染空載體的Mock/HepG2細(xì)胞明顯加快，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示HBx基因可促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞生長。見圖2。

圖1 Western blot檢測HSF1和HBx蛋白的表達(dá)

圖2 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長曲線

2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的Mock/HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體的HBx/HepG2 細(xì)胞克隆形成明顯增多［（46.13±1.25）%vs（86.43±1.01）%，P<0.05）］，提示肝癌 HepG2細(xì)胞 HBx和HSF1相互作用影響細(xì)胞平板克隆形成。見圖3。

圖3 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞平板克隆形成

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕24 h后，和轉(zhuǎn)染空載體的Mock/HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體的HBx/HepG2細(xì)胞在劃痕兩側(cè)逐漸向中間遷移，愈合速度增快［（24.18±0.98）%vs（59.03±0.83）%，P<0.05］。見圖4。

圖4 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞遷移能力

2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用覆蓋有Matrigel的Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染后肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和轉(zhuǎn)染空載體的Mock/HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx載體的HBx/HepG2細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，侵襲能力增強(qiáng)［（22.47±2.05）%vs（51.01±1.75）%），P<0.05］。見圖 5。

圖5 pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞侵襲能力

3 討論

研究表明肝癌的發(fā)生發(fā)展是多階段、多因素、多基因參與的復(fù)雜過程［6］。大量證據(jù)已證明HBV感染是肝癌的主要病因之一［7］，HBx基因編碼的HBx蛋白具有強(qiáng)大的惡性轉(zhuǎn)化能力，可調(diào)控多種細(xì)胞過程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等，可直接誘導(dǎo)肝癌發(fā)生，并增加其惡性表型，還與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)［8］。Chen等［9］研究發(fā)現(xiàn) HBx可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，上調(diào)β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移。Kongkavitoon等［10］研究發(fā)現(xiàn)沉默HBx基因可抑制HepG 2.2.15細(xì)胞Delta-Like 4/Notch1蛋白表達(dá)，其分子機(jī)制可能與Notch激活有關(guān)。Peng等［11］研究發(fā)現(xiàn)HBx和SP1相互作用可直接激活DKK1啟動(dòng)子，促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移。由此可見，HBx蛋白在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

熱休克反應(yīng)（heat shock response，HSR）是一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，在機(jī)體受到缺氧、缺血、過熱和炎癥等有害刺激時(shí)，激活熱休克轉(zhuǎn)錄因子（heat shock factors，HSFs）可促進(jìn)熱休克蛋白表達(dá)，如HSP110、HSP90、HSP70/HSP72、HSP60和HSP27等，保護(hù)機(jī)體免受蛋白毒性應(yīng)激而度過病理狀態(tài)，從而減輕損傷，增加細(xì)胞存活能力［12-13］。人類HSFs家族成員包括 HSF1、HSF2和HSF4，其中HSF1是調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激熱休克反應(yīng)最主要的調(diào)控因子，與蛋白折疊、細(xì)胞周期DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、能量代謝等相關(guān)［14］。近年的研究發(fā)現(xiàn)HSF1不但可增加腫瘤中熱休克蛋白的表達(dá)，亦可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性行為［15］。Ma等［16］研究發(fā)現(xiàn)低糖環(huán)境可誘導(dǎo)HSF1/S326磷酸化、上調(diào)B-crystallin和HSP70蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。Li等［17］研究發(fā)現(xiàn)HSF1可激活MicroRNA-135b，促進(jìn)SMMC-7721和Huh-7肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。Fang等［18］研究發(fā)現(xiàn)HSF1在多結(jié)節(jié)、血管侵犯和缺乏包膜肝癌組織中高表達(dá)，與預(yù)后不良呈正相關(guān)。有研究認(rèn)為HSF1通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和抑制抗腫瘤免疫，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展［19］，是肝癌潛在的治療靶點(diǎn)［20］。上述研究結(jié)果表明HSF1與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，了解HSF1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，可能有助于肝癌治療找到新的契機(jī)。

Li等［21］研究發(fā)現(xiàn)，HBx基因轉(zhuǎn)染的肝癌 HepG2細(xì)胞可激活c-Myc而上調(diào)HSP90蛋白表達(dá)?？梢姡琀Bx和熱休克蛋白密切相關(guān)，但目前尚無HBx蛋白與HSF1關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。為研究HBx和HSF1相互作用對(duì)肝癌生長的影響，本研究將過表達(dá)HBx的pcDNA3.1-HBx載體轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，提取蛋白后通過Western blot技術(shù)檢測HBx和HSF1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)入HBx基因后HBx和HSF1蛋白表達(dá)量增加，且促進(jìn)細(xì)胞增殖、平板克隆形成、遷移和侵襲能力。因此推測HBx和HSF1不僅與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而且很可能在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，但兩者發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究初步發(fā)現(xiàn)HBx和HSF1相互作用影響了肝癌細(xì)胞生長，這可能是誘發(fā)肝癌惡性轉(zhuǎn)化的新機(jī)制。但本實(shí)驗(yàn)僅做初步研究，還需要進(jìn)一步深入闡明HBx和HSF1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，為肝癌的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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［2017-02-28收稿］［2017-04-15修回］［編輯 羅惠予］

Effects of hepatitis B virus X gene on expression of HSF1 and growth in HepG2 human hepatoma cells

ObjectiveTo explore the effects of the hepatitis B virus X gene（HBx）on expression of heat shock transcription factor 1（HSF1）and growth of HepG2 hepatocellular carcinoma cells.MethodsHepG2 cells were transfected with empty pcDNA3.1 vector or pcDNA3.1 encoding HBx using Lipofectamine 2000.After 24 h，the two groups of transfected cells were compared in terms of HSF1 and HBx protein expression（Western blot），MTT assay，plate clone formation，wound healing，and Transwell assay.ResultsHBx and HSF1 proteins were expressed at significantly higher levels in the cells transfected with pcDNA3.1-HBx than in cells transfected with empty vector.Cells transfected with the HBx gene showed significantly greater colony formation（86.43±1.01%vs 46.13±1.25%，P<0.05），invasion （51.01±1.75%vs 22.47±2.05%，P<0.05）and migration （59.03±0.83%vs 24.18±0.98%，P<0.05）.ConclusionTransfecting the HBx gene into HepG2 cells up-regulates expression of HBx and HSF1，which promotes the growth of hepatoma cells.

Liver neoplasm；Hepatitis B virus X（HBx）；Heat shock transcription factor 1（HSF1）；Hepatoma HepG2 cells；Cell growth

Huang Hai.E-mail：nnsyy2016@aliyun.com

R735.7

A

1674-5671（2017）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.12

Zhang Zhi1，Guo Peng2，Sun Xing1，Xiao Yi1，Xu Jing3，Peng Tao3，Zhao Guoliang3，Wu Shuyue4，Huang Hai1

（1Department of Hepatobiliary and pancreas Surgery,the First People's Hospital of Nanning，Nanning 530022，P.R.China；2Department of the Dental Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；3Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；4Department of Pediatrics，the First People's Hospital of Nannin，Nanning 530022，P.R.China）

廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（GXMUYSF201542）；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（20163130）

黃海。E-mail：nnsyy2016@aliyun.com