雷雯雯 郭曉芳 付士紅 馮云 楊中華 王環(huán)宇 何英 高曉艷 呂志 周紅寧 梁國棟

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室(雷雯雯、付士紅、王環(huán)宇、何英、高曉艷、呂志、梁國棟)；665000 普洱，云南省寄生蟲病防治所 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室(郭曉芳、楊中華、周紅寧)；671000 大理，云南省地方病防治所 云南省病毒立克次體研究中心(馮云)

·論著·

2012年云南省邊境地區(qū)蚊蟲及蚊傳蟲媒病毒調(diào)查

雷雯雯 郭曉芳 付士紅 馮云 楊中華 王環(huán)宇 何英 高曉艷 呂志 周紅寧 梁國棟

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室(雷雯雯、付士紅、王環(huán)宇、何英、高曉艷、呂志、梁國棟)；665000 普洱，云南省寄生蟲病防治所 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室(郭曉芳、楊中華、周紅寧)；671000 大理，云南省地方病防治所 云南省病毒立克次體研究中心(馮云)

目的了解云南省南部邊境地區(qū)蚊蟲中蟲媒病毒的分布特點，為蟲媒病毒病防治提供科學(xué)依據(jù)。方法2012年7—8月在云南省西雙版納傣族自治州勐海縣打洛鎮(zhèn)和普洱市江城縣整董鎮(zhèn)采集蚊蟲標本，用組織培養(yǎng)法分離病毒，使用蚊媒病毒種屬特異性引物對陽性病毒分離物進行鑒定。結(jié)果共采集蚊蟲標本6屬17種18 714只。三帶喙庫蚊為當?shù)貎?yōu)勢蚊種，占蚊蟲采集總數(shù)的59.74% (11 179/18 714只)。從采集的蚊蟲標本中分離到23株病毒分離物，其中2株坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)、3株乙腦病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、2株蓋塔病毒(Getah virus, GETV)、4株版納病毒(Banna virus, BAV)、9株濃核病毒(Densovirus, DNV)和3株套式病毒(Nam Dinh virus, NDiV)。結(jié)論云南省邊境地區(qū)不僅蚊蟲種類豐富，而且蚊蟲攜帶多種蟲媒病毒。

云南省位于中國西南部，其西部同緬甸接壤，南部同老撾、越南毗連，中老緬邊境地區(qū)屬于熱帶、亞熱帶季風(fēng)氣候，全年高溫，夏季濕熱多雨，有利于蚊媒和其宿主動物的生存、繁殖以及蟲媒病毒的存在和傳播[1-3]。大量的調(diào)查和研究證實，云南省存在多種蟲媒病毒病的法定報告?zhèn)魅静?，包括登革?Dengue fever, DEN)、流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)、森林腦炎(Tickborne encephalitis, TBE)等[4]。對該地區(qū)進行血清流行病學(xué)調(diào)查，顯示乙腦病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、登革熱病毒(Dengue fever virus, DFV)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus, SINV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIV)、巴泰病毒(Batai virus, BATV)等10余種蟲媒病毒抗體為陽性[5]。而與云南省直接相鄰的東南亞國家均為多種蟲媒病毒病的流行區(qū)，由于云南省特殊的地理位置，與東南亞國家之間的邊貿(mào)往來頻繁，為蟲媒病毒的傳入和輸出創(chuàng)造了條件。鑒于此，本研究于2012年夏季在云南省南部邊境地區(qū)采集蚊蟲標本，進行蟲媒病毒監(jiān)測研究，以掌握該地區(qū)蚊蟲種類及蚊傳蟲媒病毒分布情況，為當?shù)丶膊》揽靥峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標本采集2012年7—8月，利用光催化誘蚊器和光誘蚊燈在云南省西雙版納傣族自治州勐?？h打洛鎮(zhèn)城子村、曼掌村和普洱市江城縣整董鎮(zhèn)麻木樹村、曼賀村四個村莊居民區(qū)的人房、竹林、牛圈、豬圈中采集蚊蟲標本。將蚊蟲置于-20 ℃冰箱冷凍至死，在冰排上分類鑒定蚊種，50～100只同屬蚊蟲裝入1支細胞凍存管，登記標號后凍存于液氮中運輸至本實驗室。

1.2標本處理與病毒分離首先將凍存的蚊蟲標本倒入預(yù)冷的裝有4.5 mm銅珠和1.5 ml研磨液(含50% DMEM、50% 1640、雙抗、谷氨酰胺)的無菌離心管中，在組織震蕩儀(Qiagen，德國)上4 ℃振蕩研磨3 min。隨后將蚊蟲研磨液4 ℃ 12 000×g離心30 min，上清液接種C6/36和BHK-21細胞，并分別置于28 ℃和37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察細胞病變(Cytopathic effect, CPE)情況。當CPE達約80%時收獲，以-20 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清再次接種兩種細胞，連續(xù)盲傳3代，保留有規(guī)律CPE的分離物。

1.3病毒鑒定采用QIAamp Viral RNA提取試劑盒(Qiagen，德國)按照操作說明從細胞培養(yǎng)上清中提取病毒核酸，使用隨機引物pd(N)6和Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads試劑盒(GE Healthcare，英國)獲得病毒cDNA。分別使用黃病毒屬[6]、甲病毒屬特異性引物[6]、JEV E基因片段[7]、蓋塔病毒(Getah virus，GETV)E2基因片段[8]、濃核病毒(Densovirus, DNV)NS1基因片段[9]、版納病毒(Banna virus, BAV)第12節(jié)段引物[10]、套式病毒(Nam Dinh virus, NDiV)S基因特異性引物[11]進行PCR擴增，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，回收陽性PCR產(chǎn)物并進行測序分析。

2 結(jié)果

2.1蚊蟲分布2012年7—8月在云南省西雙版納傣族自治州勐海縣打洛鎮(zhèn)和普洱市江城縣整董鎮(zhèn)共采集到6屬17種18 714只蚊蟲標本(表1)。其中打洛鎮(zhèn)采集4屬10種11 905只蚊蟲，優(yōu)勢蚊種為三帶喙庫蚊(9 090只)、騷擾阿蚊(1 087只)和白紋伊蚊(1 006只)；整董鎮(zhèn)采集6屬16種6 809只蚊蟲，優(yōu)勢蚊種為三帶喙庫蚊(2 089只)、圓斑伊蚊(1 140只)和棋斑按蚊(949只)。兩地優(yōu)勢蚊種為三帶喙庫蚊11 179只(59.74%)、白紋伊蚊1 471只(7.86%)。

2.2病毒分離將所有蚊蟲標本分為246批進行研磨，分別接種C6/36和BHK-21細胞并連續(xù)盲傳3代，最終獲得23株陽性分離物，其中有7株分離物同時對C6/36和BHK-21細胞致病變，16株分離物只對C6/36細胞致病變。陽性分離物的病變時間和病變特征如表2所示。

表1 云南省2012年采集蚊蟲標本的數(shù)量及構(gòu)成比

表2 云南省2012年病毒分離物病變時間和病變特征

注：-表示無細胞病變

Note:- indicates lack of cytopathic effect(CPE)

2.3病毒的分子生物學(xué)鑒定分別使用黃病毒屬、甲病毒屬通用引物、JEV、GETV、DNV、BAV和NDiV特異性引物對23株陽性分離物進行PCR擴增，陽性片段經(jīng)測序比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株分離物為JEV(YN12050、YN12059、YN12147)，2株分離物為TMUV(YN12115、YN12193)，2株分離物為GETV(YN12031、YN12042)，9株分離物為DNV(YN12035、YN12047、YN12067、YN12072、YN12098、YN12136、YN12186、YN12211、YN12230)，4株分離物為BAV(YN12053、YN12113、YN12234、YN12243)，3株分離物為NDiV(YN12039、YN12040、YN12060)。

3 討論

資料表明，云南蚊類共有7屬230多種[12]。本次研究對云南省南部邊境地區(qū)開展蚊蟲種類及蚊媒病毒調(diào)查，采樣時間選擇在2012年7月至8月的雨季，是蚊蟲活動最頻繁的時間段，采集到的蚊蟲種類更具有普遍性。本次蚊蟲調(diào)查結(jié)果顯示，在該2個地區(qū)共采集到6屬17種18 714只蚊蟲標本，包括庫蚊、伊蚊、按蚊、領(lǐng)蚊、杵蚊、阿蚊屬，提示邊境地區(qū)蚊蟲種類較多。通過分析2個地區(qū)的蚊蟲數(shù)量和種類發(fā)現(xiàn)，打洛鎮(zhèn)2個采集點的標本數(shù)量最多，4屬10種蚊蟲共11 905只，占整個標本采集數(shù)量的63.62%；整董鎮(zhèn)2個采集點共采集到6屬16種蚊蟲6 809只，占整個標本采集數(shù)量的36.38%。總體來看，打洛鎮(zhèn)采集到的標本數(shù)量最多，但種類相對較少；整董鎮(zhèn)采集到的標本種類更多，蚊種更為豐富，但數(shù)量相對較少。研究結(jié)果為當?shù)叵x媒生態(tài)研究和防控提供了參考。

云南省位于我國西南邊境，與云南省直接相鄰的東南亞國家均為多種蟲媒病毒病的流行區(qū)，多種蟲媒病毒廣泛存在[13]。本次調(diào)查在中緬邊境的西雙版納傣族自治州勐海縣打洛鎮(zhèn)和中老邊境地區(qū)的普洱市江城縣整董鎮(zhèn)分離到BAV、JEV、TMUV、GETV、DNV和NDiV 4個科5個屬的6種病毒共23株，表明邊境地區(qū)存在多種蟲媒病毒。其中在打洛鎮(zhèn)分離到BAV、JEV、TMUV、GETV、DNV和NDiV 6種病毒共17株，在整董鎮(zhèn)分離到BAV、JEV、TMUV、DNV 4種病毒共6株，提示不同采集點分離的蟲媒病毒種類和數(shù)量有差異。

蟲媒性傳染病大多是自然疫源性疾病，分布廣，危害大，發(fā)病多，云南省近年常發(fā)生蟲媒病毒病的暴發(fā)流行[4]。自20世紀80年代以來，經(jīng)過大量的調(diào)查和研究，已多次從云南省的標本(包括患者、蚊蟲、鳥、蝙蝠、蜱、蠓等)中分離到JEV、DFV、森林腦炎病毒(Tickborne encephalitis virus，TBEV)、SINV、CHIV、GETV、BAV、Kadipiro病毒、Toti病毒、BATV、云南環(huán)狀病毒(Yunnan orbivirus，YUOV)等10多種病毒，本次調(diào)查從采集的蚊蟲標本中分離到BAV、JEV、TMUV、GETV、DNV和NDiV共6種病毒，其中TMUV首次從云南蚊蟲分離，NDiV病毒繼深圳發(fā)現(xiàn)我國首株全球第二株NDiV后，這是我國發(fā)現(xiàn)的全球第三株NDiV。了解云南邊境地區(qū)蟲媒病毒的種類、分布和宿主媒介特點，對當?shù)叵x媒病毒病的防治具有現(xiàn)實意義。

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InvestigationofmosquitoesandarbovirusesintheborderareasofYunnanprovince,2012

LeiWenwen,GuoXiaofang,FuShihong,FengYun,YangZhonghua,WangHuanyu,HeYing,GaoXiaoyan,LyuZhi,ZhouHongning,LiangGuodong
StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(LeiWW,FuSH,WangHY,HeY,GaoXY,LyuZ,LiangGD);YunnanProvincialKeyLaboratoryofVector-borneDiseasesControlandResearch,YunnanInstituteofParasiticDiseases,Pu’er665000,China(GuoXF,YangZH,ZhouHN);YunnanInstituteofEndemicDiseaseControlandPrevention,YunnanProvincialCenterofVirusandRickettsiaResearch,Dali671000,China(FengY)

s:ZhouHongning,Email:zhouhn66@163.com;LiangGuodong,Email:gdliang@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the distribution patterns of arboviruses in Yunnan province near the China-Laos-Myanmar border, China, and to provide evidence for prevention and control of arboviruses diseases.MethodsMosquito samples were collected in Daluo county of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture and Zhengdong county of Pu’er city in Yunnan province, 2012. Viruses were isolated from the samples by tissue culture, positive isolates were identified by RT-PCR with arbovirus species-specific primers, for further sequencing and phylogenetic analysis.ResultsA total of 17 species of mosquitoes from 6 genera were collected. A total of 24 strains of viruses were isolated from the mosquito pools and identified as Tembusu virus (TMUV) (2 strains), Japanese encephalitis virus (JEV) (3 strains), Getah virus (GETV) (2 strains), Banna virus (BAV) (4 strains), Densovirus (DNV) (9 strains) and Nam Dinh virus (NDiV) (3 strains).ConclusionsThe China-Laos-Myanmar border of Yunnan province is rich in species of mosquitoes and arboviruses.

Arbovirus; Yunnan province; Investigation

蟲媒病毒；云南?。徽{(diào)查

2017-05-19)

(本文編輯：呂新軍)

雷雯雯，郭曉芳，付士紅對本文同等貢獻

周紅寧，Email：zhouhn66@163.com；梁國棟，Email：gdliang@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.008

國家自然科學(xué)基金(81290342)；傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室項目(2014SKLID103)

LeiWenwen,GuoXiaofangandFuShihongcontributedequallytothisarticle.

Fundprograms: National Natural Science Foundation (81290342); Development Grant of State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control (2014SKLID103).