唐靜 辛麗 李曉丹 陳永坤 郭俊峰 黃維娟 成艷輝 王大燕 舒躍龍

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·技術(shù)方法·

2015—2016年度中國(guó)甲型H1N1亞型流感病毒疫苗候選株的制備及鑒定

唐靜 辛麗 李曉丹 陳永坤 郭俊峰 黃維娟 成艷輝 王大燕 舒躍龍

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的為獲得2015—2016年度中國(guó)流行的甲型H1N1亞型流感病毒疫苗候選株，制備流感病毒重配株并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法采用經(jīng)典重配的方法，將H1N1亞型流感病毒流行株與H3N2亞型的雞胚高產(chǎn)重配母本株(X-157株)在雞胚上進(jìn)行混合培養(yǎng)。用H3亞型的HA蛋白抗血清和X-157株全病毒抗血清對(duì)混合培養(yǎng)病毒進(jìn)行陰性篩選。陰性篩選后HA滴度較高的病毒用Real-Time PCR法對(duì)表面蛋白基因型進(jìn)行鑒定。對(duì)表面蛋白基因型正確的毒株用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定法鑒定其內(nèi)部基因組成。進(jìn)一步對(duì)HA和NA基因進(jìn)行Sanger法測(cè)序，并用表面基因無(wú)氨基酸位點(diǎn)突變的毒株免疫雪貂，進(jìn)行雙向血凝抑制(Two-way hemagglutination inhibition test, HI)試驗(yàn)。結(jié)果Real-Time PCR篩選出5株表面蛋白基因型正確的毒株。經(jīng)內(nèi)部基因鑒定其中4株為6+2組成，1株為5+3組成。5株重配株的HA和NA基因均未發(fā)生氨基酸位點(diǎn)突變。5株重配株HA滴度均維持在1 024以上。最終選取的12號(hào)重配株免疫原性良好，HI滴度達(dá)5 120，雙向HI試驗(yàn)均通過(guò)。重配后疫苗株在雞胚上的產(chǎn)量是重配前野毒株的64倍。結(jié)論成功制備了2015—2016年度中國(guó)流行的甲型H1N1亞型流感病毒疫苗株，為疫苗貯備和疾病防控奠定了基礎(chǔ)。

流感病毒每年暴發(fā)流行是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。流感病毒根據(jù)病毒基質(zhì)蛋白及核蛋白的抗原性分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感最常見(jiàn)，在人群中流行的主要為H1、H2、H3甲型流感病毒[2]。

流感病毒表面基因易發(fā)生變異,世界衛(wèi)生組織(World health organization, WHO)每年會(huì)基于流行株的播散地理范圍及疫苗株對(duì)新流行株的保護(hù)效果等因素提供當(dāng)年度的疫苗推薦株[3]。一般情況下，流行株在雞胚或細(xì)胞基質(zhì)上的復(fù)制能力有限，產(chǎn)量較低。A型流感病毒可通過(guò)與高產(chǎn)骨架株重配的方法而提高產(chǎn)量[4]。中國(guó)尚不具備自主制備季節(jié)性流感疫苗株的能力，每年使用的疫苗株為WHO推薦的當(dāng)年度的北半球季節(jié)性流感疫苗株，有時(shí)推薦株與中國(guó)流行株并不能完全匹配從而降低了疫苗保護(hù)效果[5]。2009年之后甲型H1N1流感病毒毒株成為H1N1亞型季節(jié)性流感的主要流行株，A/California/7/2009 (H1N1)pdm09類似株是流感疫苗中H1N1亞型組分[6]。2015—2016年度中國(guó)流感流行季節(jié)分離出的一株甲型H1N1流感病毒在進(jìn)化樹(shù)上與疫苗組分不在同一分支。為了獲得該株甲型H1N1流感病毒疫苗候選株，作為疫苗儲(chǔ)備，本研究利用流感病毒經(jīng)典重配的方法，制備了2015—2016年度中國(guó)甲型H1N1流感疫苗候選株并對(duì)其進(jìn)行鑒定。本研究結(jié)果為中國(guó)自主研發(fā)制備流感疫苗株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑Real-Time PCR儀為安捷倫Mx3005P型號(hào)，用MxPro軟件進(jìn)行結(jié)果分析。PCR儀為Eppendorf Mastercycle型號(hào)。凝膠成像儀為Biorad公司GeldocXR型號(hào)。Real-Time PCR試劑為AB公司Ag-path One-step RT-PCR kit。RT-PCR試劑為TaKaRa One Step RNA PCR Kit。病毒RNA提取試劑盒為Qiagen公司RNeasy Mini Kit。凝膠回收試劑盒為Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。Real-Time PCR引物由上海生工合成。

1.2病毒、抗血清和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物甲型H1N1流感病毒A/Shanghai-Putuo/SWL1860/2015(以下簡(jiǎn)稱1860株)由國(guó)家流感中心測(cè)序鑒定并保存，該病毒接種雞胚收獲的尿囊液的血凝滴度為16。重配母本株NYMC X-157株(以下簡(jiǎn)稱為X-157株，GeneBank序列號(hào)： KJ942735)是H3N2亞型重配毒株，其內(nèi)部基因來(lái)自A/PR/8/34(H1N1)病毒，在雞胚中高產(chǎn),由英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所(National institute for biological standards and control，NIBSC)惠贈(zèng)。X-157株的全病毒兔抗血清(HI：2560)及其HA蛋白兔抗血清(HI:2560) 由本實(shí)驗(yàn)室自制[7]。9～11日齡SPF級(jí)雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。6個(gè)月齡雌性雪貂購(gòu)自無(wú)錫珊瑚礁生物技術(shù)有限公司。1860株全病毒雪貂抗血清(HI:1280)由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3引物設(shè)計(jì)及Real-TimePCR用Oligo7軟件設(shè)計(jì)Real-Time PCR引物探針，并進(jìn)行Real-Time PCR。Real-Time PCR反應(yīng)體系為25 μl：酶1 μl，正反向引物及探針各0.5 μl，模板1 μl，2x PCR Buffer12.5 μl，加去離子水至25 μl。反應(yīng)條件：45℃10 min,95℃10 min,95℃15 s和60℃45 s，最后2個(gè)條件循環(huán)40次，并用MxPro軟件進(jìn)行結(jié)果分析。Real-Time PCR鑒定HA和NA基因的引物探針序列見(jiàn)表1。

1.4雙病毒混合培養(yǎng)及陰性篩選1860株與X-157株按不同稀釋度交叉配比混合培養(yǎng)，接種SPF級(jí)雞胚，35 ℃培養(yǎng)48 h。取50 μl病毒雞胚尿囊液與50 μl X-157株HA蛋白抗血清和50 μl X-157株全病毒抗血清混合室溫孵育1 h，然后用1 x PBS溶液調(diào)至400 μl，接種2枚SPF雞胚，每枚雞胚接種200 μl。經(jīng)4輪陰性篩選，選擇表面基因亞型為H1N1的且血凝滴度最高的12株病毒，用Real-Time PCR法對(duì)HA和NA基因亞型進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定為H1N1亞型，且血凝滴度較高的毒株繼續(xù)進(jìn)行2輪有限稀釋培養(yǎng)。血凝滴度測(cè)定和有限稀釋培養(yǎng)方法參見(jiàn)[8，9]。

表1 Real-Time PCR表面基因型鑒定引物探針Tab.1 Oligonucleotide Primers used in RT-PCR

注：F:正向;R: 反向

Note:F:Forward; R:Reverse

表3 Real-time PCR 鑒定1860株與X-157株的重配株的表面蛋白基因型Tab.3 Identification of surface protein genes of reassortment strains from 1860 strain and X-157 strain by Real-time PCR method.

Note. ND: Not detected

1.5內(nèi)部基因鑒定用NEB Cutter在線工具對(duì)1860株和X-157株的M、NS、NP、PA、PB1和PB2基因進(jìn)行分析，選擇合適的限制性內(nèi)切酶。6個(gè)內(nèi)部基因酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)及內(nèi)切酶選擇如表2所示。

用通用引物將A/Shanghai-Putuo/SWL1860/2015、X-157株和5株重配株的M、NS和NP基因進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增[9]，PA、PB1和PB2進(jìn)行部分?jǐn)U增。擴(kuò)增后對(duì)目的片段進(jìn)行凝膠回收，酶切，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，凝膠成像儀成像。

1.6HA、NA基因測(cè)序?qū)㈣b定正確的重配株的HA和NA片段送至寶生物公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，序列用DNAStar軟件進(jìn)行拼接，用Mega5軟件與原始毒株的HA和NA序列進(jìn)行比對(duì)分析，查看有無(wú)氨基酸位點(diǎn)突變。

表 2 內(nèi)部基因片段鑒定用限制性內(nèi)切酶Tab.2 Restriction Enzymes used for RFLP

1.7重配株雪貂抗血清制備選擇一株表面基因無(wú)突變的重配株500 μl滴鼻免疫一只6月齡雌性雪貂。免疫2周后收集雪貂血清。雪貂血清與RDE試劑按1∶4比例混合，37 ℃水浴放置18 h去除非特異性因素，56℃30 min破壞補(bǔ)體。

1.8雙向血凝抑制試驗(yàn)(Two-wayHemagglutinationinhibitionTest,HI)單向HI試驗(yàn)將鑒定正確的重配株、1860株和X-157株與1860株雪貂血清做HI試驗(yàn)。HI試驗(yàn)按照WHO頒布的流感病毒實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)和病原學(xué)檢測(cè)手冊(cè)[8]。雙向HI試驗(yàn)：將最終選定的一株重配株、1860株和X-157株與最終選定重配株的雪貂血清做HI試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1重配株表面蛋白基因型的鑒定為了確定重配株的表面蛋白基因型，本研究設(shè)計(jì)了Real-Time PCR鑒定體系，引物探針經(jīng)鑒定，敏感性和特異性良好。對(duì)HA滴度最高的12株重配株的表面蛋白基因型進(jìn)行鑒定，Real-time PCR鑒定結(jié)果如表3所示，最終選擇了HA基因?yàn)镠1，NA基因?yàn)镹1的5株重配株：2號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)。

表4 重配株內(nèi)部基因酶切鑒定Tab.4 Identification of internal genes of reassortment viruses

2.2內(nèi)部基因鑒定對(duì)2號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)重配株的內(nèi)部基因鑒定用了內(nèi)切酶方法，對(duì)5個(gè)重配株內(nèi)部基因片段進(jìn)行酶切后，鑒定結(jié)果如表4所示：

酶切鑒定結(jié)果表明，2號(hào)、5號(hào)、9號(hào)和12號(hào)重配株的6個(gè)內(nèi)部基因均來(lái)自X-157株，即6+2組成。11號(hào)重配株的PB2基因來(lái)自1860株，其他片段來(lái)自X-157株，即5+3組成。

2.3HA、NA基因序列測(cè)定Sanger測(cè)序序列比對(duì)結(jié)果表明，獲得的5株重配株其HA和NA基因與其母本毒株序列比較，均未見(jiàn)氨基酸位點(diǎn)的突變。

2.4重配株接種雞胚后病毒滴度分析為了分析獲得的5株重配株其病毒滴度水平，我們將重配株接種雞胚，獲得病毒增殖的尿囊液，對(duì)其HA滴度分析表明，均穩(wěn)定維持在1 024以上，是重配前野毒株的64倍，是現(xiàn)有疫苗組分A/California/7/2009 (H1N1)pdm09(HA滴度：128)的8倍。

2.5雙向血凝抑制試驗(yàn)上述5株重配株表面蛋白基因型均是H1N1亞型，HA和NA基因均未發(fā)生氨基酸突變，其HA滴度均為1 024。2號(hào)、5號(hào)、9號(hào)和12號(hào)重配株內(nèi)部基因組成均為6+2，11號(hào)重配株組成為5+3。隨機(jī)選擇12號(hào)重配株開(kāi)展進(jìn)一步雙向HI實(shí)驗(yàn)。雙向血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示12號(hào)重配株與其對(duì)應(yīng)野毒株抗原性上無(wú)差異，雙向血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)通過(guò)。

3 討論

2009年甲型H1N1流感病毒通過(guò)人傳人途徑導(dǎo)致全球大流行，嚴(yán)重威脅全球的公共衛(wèi)生。至今，甲型H1N1流感依然在世界各地不斷發(fā)生流行。甲型H1N1流感病毒傳染性強(qiáng)、傳播速度快，主要通過(guò)空氣和密切接觸傳播，同其他甲型流感病毒一樣在臨床上表現(xiàn)以發(fā)熱、流涕、咳嗽、頭痛為主[10]。

表5 重配株雙向HI試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Two-way test of reassortment strains

疫苗是預(yù)防流感病毒感染及控制疫情擴(kuò)散的最有效手段[11-15]。流感病毒疫苗株是將流行株與雞胚高產(chǎn)株共同感染雞胚后經(jīng)過(guò)一系列篩選得到的具有流行株HA(血凝素)基因和NA(神經(jīng)氨酸酶)基因，內(nèi)部基因來(lái)自高產(chǎn)株的重配株[16]。2012年以來(lái)本實(shí)驗(yàn)室一直致力于中國(guó)季節(jié)性流感疫苗株制備技術(shù)平臺(tái)的建立。通過(guò)前期摸索和試驗(yàn)[7,17-18]，初步建立了中國(guó)季節(jié)性流感疫苗株制備技術(shù)平臺(tái)。本研究利用該平臺(tái)制備了2015—2016年度中國(guó)甲型H1N1亞型重配株。A/Shanghai-Putuo/SWL1860/2 015株重配前HA滴度為16，重配后HA滴度為1024，產(chǎn)量提高了64倍。該重配株與A/California/7/2009 (H1N1)pdm09重配疫苗株(HA滴度為128)相比，產(chǎn)量是其8倍。重配株表面基因通過(guò)Real-time PCR、測(cè)序鑒定和血清學(xué)檢測(cè)證明重配株HA和NA基因與流行株一致，未發(fā)生變異。

在進(jìn)行表面蛋白基因型鑒定時(shí)，從表3可以看出12株重配株利用H3亞型探針鑒定時(shí)均未檢測(cè)到Ct值，而其中7株病毒利用N2亞型探針鑒定時(shí)可見(jiàn)檢測(cè)到33.16～38.63不等的Ct值?？梢?jiàn)H3蛋白抗血清能非常有效地進(jìn)行H3蛋白的陰性篩選，而發(fā)揮N2蛋白陰性篩選作用的X-157全病毒抗血清效力相對(duì)較差。可能因?yàn)槿《局蠬A蛋白免疫優(yōu)勢(shì)的存在導(dǎo)致NA蛋白免疫原性較弱，因此NA蛋白抗血清效力較差[19-20]。為了在篩選初期得到更多目的重配株，應(yīng)該制備效力更強(qiáng)的NA蛋白(或成分)抗血清[21-22]。

內(nèi)部基因鑒定時(shí)，由于PA(2 233 nt)、PB1(2 341 nt)和PB2(2 341 nt)基因全長(zhǎng)較長(zhǎng)，PCR擴(kuò)增效率較低，因此對(duì)這3個(gè)基因并未進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，而是針對(duì)酶切位點(diǎn)位置擴(kuò)增1 000 nt左右片段。M、NS、PA和PB1基因的酶切位點(diǎn)選在X-157株上。由于X-157株NP和PB2基因PCR產(chǎn)物量較低，酶切后小片段不易觀察，因此NP和PB2基因的酶切位點(diǎn)選在1860株上。5株重配株內(nèi)部基因鑒定結(jié)果為有4株為6+2,1株為5+3。本研究成功制備了2015—2016年度中國(guó)甲型H1N1亞型流感病毒疫苗候選株，為中國(guó)自主研發(fā)制備流感疫苗株奠定了基礎(chǔ)。

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PreparationandidentificationofinfluenzaH1N1subtypevaccinecandidatestraininChina

TangJing,XinLi,LiXiaodan,ChenYongkun,GuoJunfeng,HuangWeijuan,ChengYanhui,WangDayan,ShuYuelong.

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention;KeyLaboratoryforMedicalVirology,MinistryofHealth,Beijing102206,China

ShuYuelong，Email：ysh@cnic.org.cn

ObjectiveInfluenza H1N1 subtype vaccine candidate strains from a 2015—2016 year epidemic strain in China were prepared and identified by themethod of classical reassortment.MethodsThe influenza H1N1 epidemic strain and H3N2 high-yield reassortant parental strain (X-157) were mixed and inoculated into embryonated chicken eggs by the classical reassortmentmethod . The negative selection of mixed culture virus was carried out with the antiserum of H3 protein and the antiserum of X-157 strain. Real-time PCRmethod was used to test the HA and NA genes. Restriction enzyme digestionmethod was used to identify the internal genes. HA and NA genes of selected strains were sequenced. The strain which HA and NA genes possessed the same amino acid constitution with the wild type virus was selected and immunized to ferret. Two-way test was carried out.ResultsFive strains with expected HA and NA genes were selected by real-time PCR. Internal genes were identified, with 4 strains had 6+2 constitution, 1 strain had 5+3 constitution. Comparing with the wild type virus, HA and NA genes of the 5 strains had no mutation. HA titer of reassortant strains was above 1 024. HI titer of the selected NO.12 reassortment strain reached 5 120, and two-way test was passed. The yield of reassortant strain was 64 times that of the wild type strain.ConclusionsA circulating influenza A (H1N1) strain of influenza A (2015—2016) was successfully prepared in China and laid the foundation for vaccine storage and disease prevention and control.

Influenza A virus；Classical reassortment；H1N1 subtype；Chinese epidemic strain

流感病毒A型；經(jīng)典重配；H1N1亞型；流行株

2016-11-10)

(本文編輯：陳培莉)

舒躍龍，Email:yshu@cnic.org.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.016

重大專項(xiàng)“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”-疫苗新型細(xì)胞基質(zhì)、佐劑和免疫遞送系統(tǒng)研究(2013ZX10004003)；重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)造”-流感疫苗應(yīng)急研發(fā)體系能力建設(shè)及產(chǎn)品研發(fā)(2015ZX09101044)

Fundprograms: Major Projects “Prevention and Treatment of Major Infectious Diseases Such as AIDS and Viral Hepatitis” - Study of New Cell Matrix, Adjuvant and Immune Delivery System (2013ZX10004003).Major Projects “Major New Drug Creation” - Influenza Vaccine Emergency Research and Development System, Capacity Building of Product Research and Development (2015ZX09101044)