劉林 張益 李阿茜 張碩 張全福 李川 嚴(yán)延生 馬學(xué)軍 梁米芳 李德新

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(劉林、張益、李阿茜、張碩、張全福、李川、馬學(xué)軍、梁米芳、李德新)；350001 福州，福建省疾病預(yù)防控制中心(嚴(yán)延生)

·技術(shù)方法·

應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)鑒別中國(guó)輸入性黃熱病毒野毒株與疫苗株

劉林 張益 李阿茜 張碩 張全福 李川 嚴(yán)延生 馬學(xué)軍 梁米芳 李德新

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(劉林、張益、李阿茜、張碩、張全福、李川、馬學(xué)軍、梁米芳、李德新)；350001 福州，福建省疾病預(yù)防控制中心(嚴(yán)延生)

目的鑒別2016年3月我國(guó)3例輸入性黃熱病例為2016年安哥拉流行的黃熱病毒野毒株感染，還是黃熱病毒疫苗相關(guān)疾病，亦或是二者的混合感染。方法應(yīng)用IonTorrent PGM測(cè)序平臺(tái)，對(duì)3例黃熱病病例血液或尿液標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)所獲得的3株黃熱病毒序列進(jìn)行基因組特征分析。分析黃熱病毒野毒株與疫苗株核酸序列差異，以同源性較低區(qū)域序列作為參考序列將高通量測(cè)序獲得的短序列做回貼和比對(duì)。結(jié)果從3份黃熱患者標(biāo)本中獲得了部分黃熱病毒基因組，其中從第二例患者標(biāo)本中獲得了全長(zhǎng)蛋白編碼區(qū)序列。3株病毒與2016年從中國(guó)第一例輸入性黃熱病例中分離的病毒株CNYF01R/2016株和來(lái)自安哥拉的1971年毒株Angola71株具有極高的相似性，都屬于安哥拉型黃熱病毒。分析得到5段黃熱病毒野毒株與疫苗株核酸序列差異較大的區(qū)域，在這5段區(qū)域中，3份標(biāo)本測(cè)序獲得短序列與野毒株均有多個(gè)匹配，而與疫苗株則沒(méi)有匹配。結(jié)論3例黃熱患者的血液或尿液標(biāo)本中未檢測(cè)到黃熱病毒疫苗株17D株基因組序列，高通量測(cè)序證實(shí)3人均為2016年安哥拉流行的黃熱病毒野毒株感染。

黃熱病是由黃熱病毒引起的一種急性傳染病，主要通過(guò)蚊媒傳播。黃熱病毒是黃病毒科黃病毒屬的代表種，它起源于非洲，最早的分離株(Asibi株)分離于1927年加納的黃熱病患者血液接種的恒河猴[1]。此后，黃熱病在奴隸貿(mào)易時(shí)期由非洲傳入美洲[2]，另外在歐洲也有過(guò)多次黃熱病的流行。目前，雖已具有有效的減毒活疫苗(17D疫苗株)[3]，但是在非洲、南美等很多區(qū)域黃熱病依然構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。2016年，非洲安哥拉暴發(fā)嚴(yán)重的黃熱病疫情，并首次輸入到我國(guó)，累計(jì)報(bào)道了11例輸入性病例。這些病例均為中國(guó)公民，有的去安哥拉務(wù)工前未接種過(guò)黃熱疫苗，安哥拉黃熱病疫情暴發(fā)后，在當(dāng)?shù)夭扇×藨?yīng)急接種，接種后不久，出現(xiàn)發(fā)熱等疑似黃熱病癥狀回國(guó)接受治療。有報(bào)道稱黃熱病減毒疫苗可造成嚴(yán)重疾病[4]，這些黃熱病患者是由于感染安哥拉流行的黃熱病毒野毒株，還是由于所接種的黃熱病減毒活疫苗造成的，是需要回答的的公共衛(wèi)生問(wèn)題。患者在本研究中，我們采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3份患者樣本進(jìn)行了黃熱病毒野毒株和疫苗株的鑒別。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象3例黃熱病疑似病例的標(biāo)本由福建省疾病預(yù)防控制中心采集，并送檢至中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。3例疑似病例均是在安哥拉的中國(guó)工作人員，此前都沒(méi)有接種過(guò)黃熱疫苗，安哥拉黃熱病流行暴發(fā)后才在當(dāng)?shù)亟臃N17D減毒活疫苗，而后在當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)發(fā)熱等疑似黃熱病癥狀，回國(guó)治療。3例病例的采樣信息見(jiàn)表1。樣品經(jīng)冷鏈運(yùn)送至中國(guó)疾控中心病毒病預(yù)防控制所后，立即進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

表1 病例信息

1.2RNA提取使用Qiagen 公司的RNeasy Plus Mini Kit提取患者標(biāo)本總RNA。每份標(biāo)本取100 μl嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。先將100 μl標(biāo)本與350 μl Buffer RLT Plus混合后，移入去除人基因組的純化柱，離心后取濾過(guò)液體，加入250 μl無(wú)水乙醇并混勻。將上一步的混合液移入核酸提取柱中并離心，再經(jīng)過(guò)RW1和RPE洗滌，最后用40 μl無(wú)RNase水洗脫。提取后RNA立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3核酸擴(kuò)增及定量利用Qiagen公司的REPLI-g WTA Single Cell Kit對(duì)所提取RNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組的等溫?cái)U(kuò)增。先經(jīng)過(guò)去除人基因組、逆轉(zhuǎn)錄、連接等步驟，最后利用隨機(jī)引物進(jìn)行多重置換擴(kuò)增(MDA)得到擴(kuò)增后的核酸。然后使用Thermo Fisher公司的Qubit? 3.0熒光定量?jī)x對(duì)擴(kuò)增后的核酸進(jìn)行定量。

1.4高通量測(cè)序取100 ng上一步擴(kuò)增后的核酸，使用Thermo Fisher公司的Ion XpressTMPlus Fragment Library Kit按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建(200 bp)。然后使用Ion Library Quantitation Kit對(duì)構(gòu)建好的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行qPCR定量。然后使用Ion PGMTMHi-QTMOT2 Kit，在Ion OneTouchTM2 System上進(jìn)行油包水反應(yīng)，制備測(cè)序模板。最后使用Ion PGMTMHi-QTMSequencingKit和Ion 318TM芯片，在Ion PGMTM測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.5測(cè)序數(shù)據(jù)分析使用CLC Genomics Workbench 8.5.1軟件分析高通量測(cè)序結(jié)果。分別以黃熱病毒17D疫苗株(GenBank號(hào)X03700.1)和2016年安哥拉黃熱病流行株CNYF01R/2016株(GenBank號(hào)KU921608.1)作為參考序列，將3份標(biāo)本的高通量測(cè)序得到的短序列往兩個(gè)參考序列上分別做回貼(mapping)。將得到的黃熱病毒序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST分析，然后使用MEGA6.06軟件對(duì)新獲得黃熱病毒序列與GenBank中黃熱病毒各基因型的典型毒株序列進(jìn)行Muscle法多序列比對(duì)，然后使用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Yokose病毒作為外群，Bootstrap檢驗(yàn)1 000次驗(yàn)證進(jìn)化樹(shù)有效性。

1.6疫苗株與野毒株的鑒別使用Simplot 3.5.1軟件對(duì)本次安哥拉黃熱病流行的野毒株CNYF01/2 016株與黃熱病毒17D疫苗株進(jìn)行基因組各區(qū)段的相似性對(duì)比，窗口長(zhǎng)度200 bp，步長(zhǎng)20 bp。根據(jù)上一步兩序列相似性比對(duì)結(jié)果，找出5段相似度較低的序列區(qū)段。將這5段相似度低的序列作為參考序列，使用CLC Genomics Workbench 8.5.1軟件，設(shè)置不同的匹配參數(shù)，通過(guò)匹配的結(jié)果來(lái)分析樣本中的黃熱病毒是疫苗株還是野毒株，或者是兩者的混合感染。

2 結(jié)果

2.1高通量測(cè)序應(yīng)用IonTorrent PGM測(cè)序平臺(tái)，對(duì)3份黃熱疑似病例標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序和初步序列分析。從病例2的標(biāo)本中幾乎測(cè)得了該株黃熱病毒全長(zhǎng)序列，病毒基因組覆蓋度達(dá)99.25%，其中包括了完整的開(kāi)放讀碼框區(qū)域。從病例1和病例3的標(biāo)本中僅測(cè)得了黃熱病毒的部分基因組序列，基因組覆蓋度分別為26.68%和59.89%(表2)。

表2 3份標(biāo)本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

2.23株病毒的基因特征將從3份標(biāo)本中獲得的毒株序列上傳至GenBank，編號(hào)分別為KY873606、KY873607、KY873608。根據(jù)3株黃熱病毒均有覆蓋的PreM蛋白區(qū)域(397 ～577 nt)，結(jié)合黃熱病毒其他基因型的典型毒株，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。與新獲得的3株黃熱病毒相似度最高的毒株是2016年從中國(guó)第一例輸入性黃熱病例中分離得到的CNYF01R/2016株，它們都屬于安哥拉型黃熱病毒，起源于安哥拉1971年的黃熱病流行(圖1)。

注：▲新獲得的3株黃熱病毒圖1 部分PreM基因(397～577 nt)的系統(tǒng)進(jìn)化分析Note: ▲Three newly obtained yellow fever virus strainsFig.1 Phylogenetic analysis of partial PreM gene (397～577 nt)

2.3疫苗株與野毒株的基因組的差異比較分析使用Simplot軟件將中國(guó)2016年的黃熱病毒流行株CNYF01R/2016株(KX268355)作為參考序列，比較其與黃熱病毒野毒株Angola71株(AY968064)和疫苗株17D株(X03700)的基因組各區(qū)段相似性。從圖2中可以看出，中國(guó)2016年的黃熱病毒流行株與安哥拉1971年的流行株Angola71株在基因組的各區(qū)段相似性都非常高，基本都在95%以上，而它們與疫苗株17D株差異較大。表3中列出了5段疫苗株與野毒株的基因組核酸序列差異較大的區(qū)段。

表3 疫苗株與野毒株的基因組核酸序列差異較大區(qū)段

2.4疫苗株與野毒株鑒別以表3中5個(gè)區(qū)段的兩株病毒序列分別作為參考序列，使用CLC軟件將3個(gè)標(biāo)本的測(cè)序數(shù)據(jù)分別與之比對(duì)，得到匹配的短序列數(shù)見(jiàn)表2。除病例1標(biāo)本中沒(méi)有病毒序列覆蓋區(qū)段2，在其余的區(qū)段3個(gè)標(biāo)本都有短序列覆蓋。從表3中可以看出，在5個(gè)差異較大區(qū)段，3例標(biāo)本中均未出現(xiàn)與疫苗株17D株相匹配的短序列，而都有與野毒株相匹配的序列。另外，我們還特別注意到在區(qū)段4中，CNYF01R/2016株的6 944 nt～6 946 nt的位置對(duì)比17D疫苗株插入了3個(gè)堿基CAC，導(dǎo)致在蛋白序列中插入一個(gè)組氨酸(H)。而在3份標(biāo)本中，與該區(qū)段相匹配的短序列都存在這3個(gè)堿基的插入。由此可以推斷，本研究檢測(cè)的3份標(biāo)本中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)疫苗株17D株病毒核酸，此3例黃熱病例均為2016年流行的黃熱病野毒株感染。

3 討論

本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)2016年3月份3例黃熱病輸入性病例進(jìn)行了病毒基因組解析，并應(yīng)用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件對(duì)測(cè)序獲得的黃熱病毒序列是屬于疫苗株還是野毒株，亦或兩者混合感染進(jìn)行了精準(zhǔn)鑒別。在這些患者的血液或尿液中檢測(cè)到2016年流行的黃熱病毒野毒株核酸，沒(méi)有檢測(cè)到疫苗株病毒核酸。因此，可認(rèn)為導(dǎo)致患者發(fā)病的是黃熱病野毒株而不是疫苗株，可能是患者應(yīng)急接種疫苗后，尚未產(chǎn)生足夠的保護(hù)力的情況下，即被黃熱病毒野毒株感染而發(fā)病。

本研究采用的高通量測(cè)序技術(shù)比傳統(tǒng)的一代測(cè)序技術(shù)在很多方面有著很大的優(yōu)勢(shì)，可以獲得樣本中數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)的短序列，可以查明每個(gè)短序列的來(lái)源，不僅可以檢測(cè)出樣本中的主要病毒株，還可判定檢測(cè)樣本中的混合感染情況[5]。在檢測(cè)證實(shí)這幾位黃熱患者感染是黃熱病毒野毒株的同時(shí)，明確了他們的樣本中沒(méi)有黃熱病疫苗株病毒核酸。

本研究在鑒別混合感染情況時(shí)，為防止來(lái)自不同毒株的序列拼接在一起，未對(duì)短序列進(jìn)行contig拼接，而是對(duì)每個(gè)短序列單獨(dú)進(jìn)行分析。然而對(duì)每個(gè)短序列進(jìn)行BLAST分析需要非常強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力和非常長(zhǎng)的運(yùn)算時(shí)間，更重要的是，在兩個(gè)毒株相似性高的區(qū)域出現(xiàn)的短序列，在分析時(shí)可能出現(xiàn)排在第一位的相似序列與其他相似序列區(qū)分度不明顯的現(xiàn)象，容易得出錯(cuò)誤的結(jié)論。因此本研究將高通量測(cè)序獲得的短序列采取貼到兩毒株差異較大的區(qū)域，并結(jié)合特異性突變位點(diǎn)的分析，達(dá)到了很好的鑒別效果。該研究方法也可以應(yīng)用到利用高通量測(cè)序鑒別其他病毒的混合感染。

17D減毒株制備的黃熱病疫苗可以有效預(yù)防黃熱病。雖然有過(guò)黃熱病減毒疫苗引起YEL-AND、YEL-AVD等嚴(yán)重疾病的報(bào)道[4]，但是總體上出現(xiàn)黃熱病疫苗相關(guān)疾病的幾率非常低，在全球范圍，每接種100萬(wàn)次黃熱疫苗，會(huì)出現(xiàn)從0.09次(巴西)到2.5次(美國(guó))黃熱疫苗相關(guān)疾病[6]。接種黃熱病疫苗10 d后，90%以上接種者可以獲得免疫力；接種黃熱疫苗30 d后，99%以上接種者可以獲得免疫力[7]。本研究的3位黃熱病患者在前往安哥拉之前未接種黃熱病疫苗，雖然當(dāng)?shù)攸S熱病疫情暴發(fā)之后應(yīng)急接種了疫苗，但是感染很可能發(fā)生在接種后尚未產(chǎn)生足夠免疫力或患者接種疫苗時(shí)已經(jīng)感染，處于潛伏期(3～6 d，最多14 d)未發(fā)病。因此前往黃熱病流行的國(guó)家或地區(qū)旅行或者工作的人，應(yīng)嚴(yán)格按照檢疫條例要求，在到疫情地之前至少10 d接種疫苗，到疫區(qū)后應(yīng)該提高防蚊意識(shí)并采取相應(yīng)措施。

[1] Stokes A, Bauer JH, Hudson NP. The transmission of yellow fever to Macacus rhesus. 1928[J]. Rev Med Virol, 2001, 11(3): 141-148.

[2] Barrett AD, Monath TP. Epidemiology and ecology of yellow fever virus[J]. Adv Virus Res, 2003, 61: 291-315.

[3] Theiler M, Smith HH. The effect of prolonged cultivation in vitro upon the pathogenicity of yellow fever virus[J]. J Exp Med, 1937, 65(6): 767-786.

[4] Lang J, Zuckerman J, Clarke P, et al. Comparison of the immunogenicity and safety of two 17D yellow fever vaccines[J]. Am J Trop Med Hyg, 1999, 60(6): 1045-1050.

[5] 張靜娜，王譯葵，蔣巖，等. 高通量測(cè)序技術(shù)用于丙型肝炎病毒感染溯源調(diào)查[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2016,50(6):530-534. doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.06.011

[6] Rosenthal S, Chen R. The reporting sensitivities of two passive surveillance systems for vaccine adverse events[J]. Am J Public Health, 1995, 85(12): 1706-1709.

[7] 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó)家質(zhì)檢總局. 黃熱病防控方案(2016 年版)[J]. 國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志, 2016, 6,43(3): 150-152. doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4149.2016.03.002

DistinguishvaccinestrainandwildtypestrainofyellowfevervirusimportedtoChinausinghigh-throughputsequencingtechnology

LiuLin,ZhangYi,LiAqian,ZhangShuo,ZhangQuanfu,LiChuan,MaXuejun,LiangMifang,LiDexin

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(LiuL,ZhangY,LiAQ,ZhangS,ZhangQF,LiC,MaXJ,LiangMF,LiDX);FujianProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China(YanYS)

LiDexin,Email:lidx@chinacdc.cn

ObjectiveTo identify whether the three imported yellow fever cases in China in March 2016 were infections by wild type strain of yellow fever virus in Angola in 2016, vaccine-associated disease or co-infection of both.MethodsSequences of three yellow fever virus strains were obtained by high-throughput sequencing with IonTorrent PGM platform from blood or urine samples of three yellow fever cases, and their genomic characteristics were analyzed. Then the regions with relatively great difference between the wild type strain and 17D vaccine strain were identified, and then served as the reference sequences when mapping the reads obtained by high-throughput sequencing.ResultsPartial yellow fever virus genomes were obtained from three samples of yellow fever patients, among them a full length coding region sequence was gained in sample 2. Comparing the genome sequences, the three newly obtained strains of yellow fever virus were highly similar to strain CNYF01R / 2016 which was isolated from the first imported yellow fever case to China in 2016 and strain Angola 71 from Angola in 1971, and they all belonged to Angola genotype of yellow fever virus. In this study, we found five regions in yellow fever virus genomes with great diversity between the vaccine strain and the wild type strain. In these five regions, a number of short reads obtained by high-throughput sequencing of the three samples were mapped to the sequence of wild type virus, while no short reads matched the vaccine strain.ConclusionsThere were no viral nucleic acid of 17D vaccine strain in the blood or urine samples of these three cases of yellow fever. They are all infected by wild type strains of Angola in 2016.

Yellow fever virus; High-throughput sequencing

黃熱病毒；高通量測(cè)序

2017-04-21)

(本文編輯：唐瀏英)

李德新， Email：lidx@chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.017

科技部改革發(fā)展專項(xiàng)，寨卡疫情防控科技攻關(guān)應(yīng)急專項(xiàng) [國(guó)資發(fā)2016(273)號(hào))

Fundprograms: ZIKA Special Project of the MOST Reform and Development Project [273(2016)]