肖花 廖啟成 汪海燕 劉威龍 吳馳 黃健 劉嘉林

518112 深圳市第三人民醫(yī)院(肖花、汪海燕、劉威龍、吳馳、黃健、劉嘉林)；341000 贛州，贛南醫(yī)學院(廖啟成)

·論著·

ARID1A基因突變體的構(gòu)建及其在肝癌細胞中的過表達鑒定

肖花 廖啟成 汪海燕 劉威龍 吳馳 黃健 劉嘉林

518112 深圳市第三人民醫(yī)院(肖花、汪海燕、劉威龍、吳馳、黃健、劉嘉林)；341000 贛州，贛南醫(yī)學院(廖啟成)

目的構(gòu)建人類染色體重塑復合物SWI/SNF(Switch/Sucrose NonFermentable)中重要組份ARID1A(A-T rich interaction domain)的突變過表達載體，并檢測野生型ARID1A基因及突變型ARID1A基因在肝癌細胞株HepG2中的表達情況。方法采用overlap PCR技術(shù)構(gòu)建在野生型質(zhì)粒pcDNA6-ARID1A基礎上構(gòu)建結(jié)構(gòu)域缺失突變體pcDNA6-ARID1A/ΔARID以及pcDNA6-ARID1A/Δ DUF3518；利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將野生型質(zhì)粒以及構(gòu)建的突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝癌細胞HepG2中進行過表達；通過Real-time PCR以及Western blot技術(shù)對野生型及突變型ARID1A在肝癌細胞中的表達情況進行鑒定。結(jié)果經(jīng)雙酶切后SDS-PAGE分析以及測序驗證，成功構(gòu)建了真核表達載體pcDNA6-ARID1A的突變型質(zhì)粒pcDNA6-ARID1A/ΔARID以及pcDNA6-ARID1A/Δ DUF3518；通過Real-time PCR以及Western blot的方法驗證，ARID1A及ARID1A/ΔARID在肝癌細胞株HepG2中成功過表達，而ARID1A/Δ DUF3518蛋白可能降解。結(jié)論成功構(gòu)建ARID1A功能域缺失型突變體，并在肝癌細胞株HepG2中穩(wěn)定過表達ARID1A及ARID1A/ΔARID；ARID1A/Δ DUF3518蛋白的缺失暗示DUF3518結(jié)構(gòu)域可能起著穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的功能。

肝癌是我國男性中第四常見的腫瘤，在導致癌癥相關(guān)死亡的腫瘤中排名第三，而在<60歲的的人群中，肝癌是最常見、最容易導致死亡的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，2015年中國約有466 100例新發(fā)肝癌患者，而其中約有422 100人死于肝癌。雖然目前肝癌的治療方法不少，如手術(shù)切除、微波消融、經(jīng)肝動脈化療栓塞(TACE)、化療及分子靶向治療等，但其治療效果仍不理想，預后較差。其根本原因為目前肝癌的發(fā)生發(fā)展機制尚不完全清楚，而且缺乏有效的早期診斷及治療的分子靶標。因此，深入研究肝癌的分子機制，尋找肝癌相關(guān)的原癌基因及抑癌基因，對尋找肝癌早期診斷及治療的分子靶標具有重要意義。

惡性腫瘤其實質(zhì)就是細胞生長與死亡之間的穩(wěn)態(tài)平衡發(fā)生紊亂的結(jié)果。影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因主要有兩類，即原癌基因以及抑癌基因。其中，抑癌基因是一類抑制細胞過度生長、增殖從而遏制腫瘤形成的基因，在正常細胞生命周期中發(fā)揮著重要作用。常見的抑癌基因包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rb、p53，信號通路抑制因子PTEN等等。

ARID1A(A-T Rich Interaction Domain 1A)是由Gregory等[1]在1996年新發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，這種蛋白在細胞核內(nèi)有選擇性地與富含AT堿基的DNA序列結(jié)合，但是該蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其他DNA結(jié)合蛋白缺乏序列相似性。已有研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A基因在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種人類癌細胞中具有抑癌作用[2-6]，同時還有研究表明ARID1A通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的磷酸化水平而達到抑制腫瘤細胞增殖的作用[7]，但是ARID1A在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報道。本研究擬在野生型ARID1A質(zhì)粒的基礎上，構(gòu)建ARID1A/ΔARID以及ARID1A/ΔDUF3518的真核表達載體，并使其在肝癌株HepG2中穩(wěn)定過表達，以期為進一步研究ARID1A在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 質(zhì)粒:野生型pcDNA6-ARID1A質(zhì)粒由美國約翰霍普金斯大學醫(yī)學院(Johns Hopkins University School of Medicine)Bin Guan饋贈[8]。

1.1.2 細胞株:人肝癌細胞株HepG2由本實驗室保存。

1.1.3 試劑:質(zhì)粒抽提試劑盒、RNA抽提試劑盒以及瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒均購自德國Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Opti-MEM培養(yǎng)基、顯影液(SuperSignal? West Pico)和胰蛋白酶均購自Thermo公司；常用限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH-5α、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser)以及SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自日本TaKaRa公司；脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑以及anti-V5 tag抗體購自Invitrogen公司；β-actin抗體購自CST公司。

1.2方法

1.2.1 引物的設計合成及ARID1A結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建：根據(jù)pcDNA6-ARID1A的質(zhì)粒圖譜，ARID1A基因兩端均有一個XhoI酶切位點，因此利用XhoI酶切該質(zhì)粒后，回收載體部分，再進行載體自連，即可得到空載體pcDNA6；而ARID結(jié)構(gòu)域以及DUF3518結(jié)構(gòu)域兩端分別具有HpaI和EcoRI以及EcoRV和XbaI酶切位點，切這些酶切位點在整個質(zhì)粒中是唯一的，因此根據(jù)這些位點利用Primer Primer 5設計突變體pcDNA6-ARID1A/ΔARID和pcDNA6-ARID1A/Δ DUF3518的引物，引物及序列如表1 所示，采用overlap PCR方法，分別擴增ARID和DUF結(jié)構(gòu)域兩端的小片段(4個片段分別含有HpaI和EcoRI以及EcoRV和XbaI酶切位點)，再以兩端小片段作為模板，擴增得到不含有ARID或者DUF結(jié)構(gòu)域的片段，重新連接回到質(zhì)粒上，即完成ARID或者DUF結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建。

表1 引物及序列

1.2.2 細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染: 肝癌HepG2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。收集處于對數(shù)生長期的細胞，使細胞濃度達到2.0×105/ml，按2 ml/孔的量將細胞鋪于6孔板中，待次日細胞密度達到80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。細胞分為5組：未作處理的細胞(未進行轉(zhuǎn)染)、對照組細胞(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA6)、第1實驗組細胞(轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒pcDNA6-ARID1A)、第2實驗組細胞(轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒pcDNA6-ARID1A/ΔARID)以及第3實驗組細胞(轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒pcDNA6-ARID1A/Δ DUF3518)。最后，按照脂質(zhì)體Lipo2000試劑盒說明書的操作步驟進行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)ARID1A及其突變體mRNA的表達水平分析: 利用NCBI Primer Blast設計檢測ARID1A基因的特異性引物，引物序列為：Forward:5’-AAGGGGAGATGTACAGCGTG-3’; Reverse: 5’-GGTCATGTCATTACGCCCCT-3’。由于該引物對應的擴增片段位于ARID結(jié)構(gòu)域和DUF結(jié)構(gòu)域之間，因此同樣可以用于轉(zhuǎn)染突變體ARID1A/ΔARID和ARID1A/Δ DUF3518的細胞中RNA的檢測一。分別收集1.2.2中的對照組和實驗組細胞，利用RNA提取試劑盒，按照說明書步驟分別提取總RNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行實時熒光定量PCR。PCR反應條件為：95°C 15 s；95°C 10 s、60°C 30 s，40個循環(huán)；95°C 15 s；60°C 1 min、95°C 15 s。以β-actin作為內(nèi)參基因，對ARID1A基因及其突變體的mRNA水平進行相對定量。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)ARID1A及其突變體蛋白的表達水平分析: 分別收集1.2.2中的對照組和實驗組細胞，用細胞裂解液在冰上作用10 min，4℃、13 200×g離心20 min，收集總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將凝膠上的蛋白點轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有5% BSA的TBST溶液在室溫封閉1 h，然后按照1∶1 000比例加入一抗(anti-V5 tag以及anti-β-actin)，于4°C孵育過夜。隨后利用TBST洗膜5次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫震蕩孵育1 h，同上述方法洗膜。最后，加入顯影液SuperSignal? West Pico，并于DNR化學發(fā)光微成像分析系統(tǒng)(DNR BioImaging Systems)上顯影拍照。

2 結(jié)果

2.1ARID1A蛋白二級結(jié)構(gòu)ARID1A基因表達的蛋白包含2 285個氨基酸殘基，是一個分子量較大的蛋白。我們首先基于NCBI的蛋白庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對ARID1A可能包含的二級結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果顯示該蛋白不僅含有ARID家族經(jīng)典的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其C端還含有一個未知功能的DUF3518結(jié)構(gòu)域(如圖1)。同時我們利用一款在線軟件Protein DisOrder prediction System對ARID1A蛋白的無序度進行分析，這一分析軟件主要原理是無序區(qū)域中的氨基酸殘基的高靜電荷導致的靜電排斥，以及疏水性導致蛋白無法形成緊密結(jié)構(gòu)。利用該軟件預測結(jié)果與NCBI給出的結(jié)果基本一致，都預測了ARID 結(jié)構(gòu)域以及DUF3518 結(jié)構(gòu)域的存在。這兩個結(jié)構(gòu)域如何影響ARID1A對肝癌的抑制作用，目前也沒有任何研究報道。我們在野生型ARID1A的基礎上分別構(gòu)建這兩個結(jié)構(gòu)域缺失的突變體ARID1A/ΔARID以及ARID1A/Δ DUF3518)，如圖1所示，以深入研究該結(jié)構(gòu)域在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

圖1 ARID1A及其突變體一級序列結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram showing the primary structure of ARID1A mutants used in the study

2.2ARID1A結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶XhoI對pcDNA6-ARID1A進行消化反應，電泳結(jié)果如圖2A顯示一條大小在7 000 bp左右的條帶(ARID1A基因)和一個大小在5 000 bp左右的條帶(pcDNA6載體)，將其中載體片段回收自連，即可得到pcDNA6 vector質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶EcoRV和XbaI對pcDNA6-ARID1A進行雙酶切反應，電泳結(jié)果如圖2B所示，可以得到一個大小在10 000 bp左右的條帶(pcDNA6載體和部分ARID1A基因片段)和一個2 000 bp左右的條帶(含有DUF3518結(jié)構(gòu)域的基因片段)，回收10 000 bp的條帶作為載體，同時利用overlap PCR擴增一段不含有DUF3518結(jié)構(gòu)域的片段，代替該2 000 bp片段，連接回10 000 bp載體上，及構(gòu)建得到pcDNA6- ARID1A/Δ DUF3518質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶HpaI和EcoRI對pcDNA6-ARID1A進行雙酶切反應，電泳回收11 200 bp左右的條帶(如圖2C)，同樣的方法可構(gòu)建pcDNA6- ARID1A/Δ ARID質(zhì)粒。質(zhì)粒純化后電泳鑒定大小正確(如圖2D)，并且通過測序確定野生型及突變型ARID1A序列正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)試驗。

圖3 轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)ARID1A及其突變的mRNA(A)和蛋白(B)相對表達量Fig.3 The mRNA (A) and protein (B) expression level of ARID1A and the mutants in transfected HCC cells

注：A. XhoI 酶切；B. EcoRV和XbaI雙酶切；C. HpaI和EcoRI雙酶切；D.質(zhì)粒圖2 pcDNA6-ARID1A酶切后及質(zhì)粒凝膠電泳圖 Note:A. XhoI digestion; B.EcoRV and xbaI digestion;C.HpaI and EcoRI digestion;D. Plasmids Fig.2 Electrophoresis of enzyme digested pcDNA6-ARID1A and plasmids

2.3轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)ARID1A及其突變的mRNA和蛋白相對表達量如圖3A所示，對照組(空白細胞及轉(zhuǎn)染了空載體pcDNA6的細胞)中ARID1A基因的mRNA相對表達量均在0.002(2-ΔCt)以下，而實驗組(轉(zhuǎn)染了野生型及突變型ARID1A質(zhì)粒的細胞)中ARID1A或突變體基因的相對表達量均有顯著提高，結(jié)果具有顯著差異，提示ARID1A野生型或突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并在肝癌細胞株HepG2中成功轉(zhuǎn)錄。由于無論野生型還是突變型ARID1A蛋白，在其C端均帶有一個V5 tag(如圖1)，因此可以利用anti-V5 tag抗體鑒定野生型或者突變型ARID1A蛋白表達水平。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果如圖3B，對照組(空白細胞及轉(zhuǎn)染了空載體pcDNA6的細胞)中沒有檢測出帶有V5 tag的ARID1A，而實驗組(轉(zhuǎn)染了野生型ARID1A及ARID1A/Δ ARID質(zhì)粒的細胞)中檢測到明顯的條帶，提示外源性野生型ARID1A及ARID1A/Δ ARID突變體的成功過表達；然而有意思的是并沒有檢測到ARID1A/Δ DUF3518蛋白的表達，結(jié)合圖3B的結(jié)果，ARID1A/Δ DUF3518的mRNA水平有顯著提高，而蛋白水平?jīng)]有明顯變化，暗示DUF3518結(jié)構(gòu)域的缺失很可能影響了整體蛋白的穩(wěn)定性，導致突變體蛋白的降解。

3 討論

ARID1A基因表達產(chǎn)物蛋白BAF250a在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，但處于細胞核內(nèi)的ARID1A蛋白并不穩(wěn)定[9]。ARID1A是單鏈蛋白，包括2 285個氨基酸殘基，對其二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)它主要包含兩個功能域(圖1)[10]，一個是1 014到1 101位氨基酸殘基構(gòu)成的的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ARID，該片段的三維結(jié)構(gòu)已于2004年由Kim S等人通過NMR技術(shù)成功解析，并且發(fā)現(xiàn)該片段與DNA的相互作用時，其loop區(qū)以及H4，H5螺旋上的部分殘基發(fā)生明顯的化學位移，暗示著這幾個位點在ARID1A作為SWI/SNF復合物重要組份調(diào)控染色體的重塑的過程中起到重要作用[11]。另外一個結(jié)構(gòu)域暫時被命名為DUF3518，跨度為1 975到2 231位氨基酸殘基，即未知功能的結(jié)構(gòu)域(Domain of Unknown Function)，目前尚無關(guān)于該結(jié)構(gòu)域功能方面的研究報道，不過有人推測其可能與ARID結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用，并且影響ARID與DNA的結(jié)合。

ARID1A自從被發(fā)現(xiàn)并認定是一種新型抑癌基因以來，研究者們在多種不同類型的癌細胞中開展了關(guān)于其影響癌癥發(fā)生發(fā)展的機制研究，發(fā)現(xiàn)ARID1A并非通過單一機制影響癌癥的發(fā)生發(fā)展，在不同的癌細胞中其發(fā)揮作用的途徑也不盡相同，主要有以下幾個方面：多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A沉默之后，可以激活PI3K通路，導致細胞增殖加速[7]；還有研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A基因沉默，上皮細胞標志蛋白E-cad水平降低，細胞的遷移和浸潤能力增強[12]；最近兩年關(guān)于ARID1A的研究則集中在其參與DNA的損傷修復這一細胞重要的生命活動中[13-14]。然而關(guān)于ARID1A的兩個結(jié)構(gòu)域在癌癥發(fā)生發(fā)展中的功能鮮有研究報道。我們前期工作基礎中發(fā)現(xiàn)在110例肝癌患者中存在28個位點的高頻突變，其中錯義突變位點有17個[15]，占到一半以上，并且有7個突變位點位于ARID1A功能域上(ARID結(jié)構(gòu)域以及DUF結(jié)構(gòu)域)。因此，深入研究ARID1A的兩個功能域ARID和DUF3518在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

本實驗在野生型pcDNA6-ARID1A的基礎上成功構(gòu)建pcDNA6-ARID1A/ΔARID和pcDNA6-ARID1A/ΔDUF3 518兩個突變型質(zhì)粒，并通過Real-time PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的細胞進行鑒定，結(jié)果表明野生型和突變型質(zhì)粒均可以在肝癌細胞HepG2中成功轉(zhuǎn)錄。然而Western blot實驗結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，野生型pcDNA6-ARID1A和突變體pcDNA6-ARID1A/ΔARID能夠過表達，而pcDNA6-ARID1A/ΔDUF3518卻沒有顯示出明顯的條帶，暗示該突變體蛋白很可能很快降解，因此我們推測DUF3518結(jié)構(gòu)域起著穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的功能。這些結(jié)果為我們深入研究ARID1A影響肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定了重要基礎。

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ConstructionofARID1Agenemutantsandidentificationoftheoverexpressioninhepatocellularcarcinomacells

XiaoHua,LiaoQicheng,WangHaiyan,LiuWeilong,WuChi,HuangJian,LiuJialin

ShenzhenThirdPeople’sHospital，Shenzhen518112，China(XiaoH，WangHY，LiuWL，WuC，HuangJ，LiuJL);GannanMedicalUniversity,Ganzhou341000，China(LiaoQC)

LiuJialin,Email:szliujialin@126.com

ObjectiveTo construct the mutants of ARID1A gene, which is an important component in human chromosomal remodeling complex Switch/Sucrose Non Fermentable (SWI/SNF), and identify their overexpression in liver cancer HepG2 cells.MethodsOverlap PCR was used to construct domain truncated mutantss pcDNA6-ARID1A/ΔARID and pcDNA6-ARID1A/ΔD UF3518 based on wild type plasmids pcDNA6-ARID1A. Lipofectionmethod was used to transfect the wild type and mutants into HepG2. Real-time PCR and western blotting were used to confirm the overexpression of ARID1A and the mutants.ResultsSDS-PAGE and sequencingresult confirmed the successful construction of pcDNA6-ARID1A/ΔARID and pcDNA6-ARID1A/ΔDUF3518. Real-time PCR and western blottingresult confirmed the overexpression of both mRNA and protein of wild type ARID1A and ARID1A/ΔARID. The mRNA levels indicated that ARID1A/Δ DUF3518 were overexpressed, but the protein levels were quite low.ConclusionsFunctional domain truncated mutants of ARID1A were successfully constructed. Overexpression of wild type ARID1A and ARID1A/ΔARID in liver cancer HepG2 cells was successful. Loss of ARID1A/ΔDUF3518 protein suggest that DUF3518 may contribute to the protein structure stability.

ARID1A; Functional domain; Truncated mutation; Overexpression; Liver neoplasms; Cell culture

ARID1A基因；功能域；缺失突變；過表達；肝腫瘤； 細胞培養(yǎng)

2017-08-11)

(本文編輯：馬學軍)

劉嘉林，Email: szliujialin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.015

深圳市肝膽疾病研究重點實驗室項目(ZDSYS201504301534057)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20160427183548637)

Fundprograms: Shenzhen Key Laboratory of Hepatobiliary Diseases(ZDSYS201504301534057)；Shenzhen Science and Technology Plan Project(JCYJ20160427183548637)