調(diào)控CD163基因表達(dá)的miRNA鑒定及其在PRRSV感染中的作用分析

吳俊靜+喬木+武華玉+彭先文+梅書棋

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害大、控制難的豬傳染性疾病。PRRSV必須通過特異性受體誘導(dǎo)才能入侵宿主細(xì)胞，而CD163就是其中一個(gè)關(guān)鍵受體。在獲得靶向作用CD163基因miRNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-181c、miR-4262可極顯著抑制細(xì)胞內(nèi)[WTBX][STBX]CD163mRNA的表達(dá)（P<0.01）；且在Marc-145細(xì)胞中證實(shí)miR-181c、miR-23b、miR-4262均具有極顯著抑制PRRSV增殖的功能（P<0.01），其中miR-4262抑制效果最佳。3個(gè)miRNA抗PRRSV增殖的分子機(jī)制比較復(fù)雜，miR-181c、miR-4262 可通過靶向抑制受體[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]發(fā)揮抗PRRSV增殖作用，而miR-23b是通過其他途徑發(fā)揮作用。并首次發(fā)現(xiàn)miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用，但其具體的分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）；[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因；miRNA；抗病

中圖分類號： S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0016-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31501924）；湖北省自然科學(xué)基金（編號：2015CFA105）；湖北省技術(shù)創(chuàng)新重大項(xiàng)目（編號：2016ABA117）；湖北省科技支撐計(jì)劃（編號：2014BBB010）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：2016-620-000-001-022）；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競爭性計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2016jzxjh029）。

作者簡介：吳俊靜（1984—），女，湖北武漢人，博士，助理研究員，主要從事豬遺傳育種研究。Tel：（027）87389516；E-mail：jeanne1106@126.com。

通信作者：梅書棋，碩士，研究員，主要從事豬遺傳育種研究。E-mail：msqlfe@163.com。

[ZK）]

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害極大的傳染性免疫抑制性疾病，以妊娠母豬的繁殖障礙（流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎）及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病為特征。1987年豬繁殖與呼吸綜合征首次在美國暴發(fā)，幾年之內(nèi)PRRS便席卷了北美洲、歐洲、亞太地區(qū)，至今仍在世界范圍內(nèi)流行。特別是近年來由高致病性PRRSV引起的突發(fā)疫情高熱病在我國很多省份暴發(fā)和流行，仔豬致死率高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于PRRSV具有變異快且復(fù)雜、免疫抑制、存在抗體依賴性增強(qiáng)作用等特征，目前采用疫苗等手段未能取得滿意的效果，防治PRRS仍然是養(yǎng)豬業(yè)的重大難題之一。

PRRSV有一個(gè)典型的生物學(xué)特征就是具有嚴(yán)格的宿主和細(xì)胞嗜性，它只感染豬，不感染其他物種，且主要感染單核巨噬細(xì)胞系中分化完全的細(xì)胞，尤其是豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）。在體外，PRRSV可在PAM和猴腎細(xì)胞系及其衍生細(xì)胞系（Marc-145、MA-104等）中增殖。宿主細(xì)胞膜上的一些特異性受體的存在與否決定了該細(xì)胞對PRRSV的易感性，而[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]就是PRRSV感染宿主細(xì)胞的最關(guān)鍵受體之一，它參與介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞和增殖[2]。例如，在PRRSV非易感細(xì)胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中轉(zhuǎn)染[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]真核表達(dá)質(zhì)?？梢允惯@些細(xì)胞系感染PRRSV并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生子代病毒粒子[3-4]。采用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的抗體處理PAM可以有效阻止PRRSV的感染[3]，且永生化的PAM細(xì)胞系因無法正常表達(dá)[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]而變?yōu)镻RRSV非易感細(xì)胞[5]。不僅如此，[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的表達(dá)量與PRRSV復(fù)制效率呈正相關(guān)，上調(diào)[WTBX][STBX]CD163表達(dá)會增加病毒增殖，而下調(diào)CD163[WTBZ][STBZ]表達(dá)可降低病毒增殖[6]。

MicroRNA（miRNA）是一類長約22個(gè)堿基、高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，能夠互補(bǔ)或部分互補(bǔ)地與靶mRNA結(jié)合，使mRNA降解或介導(dǎo)其翻譯抑制，作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子調(diào)控基因的表達(dá)[7]，miRNA幾乎參與調(diào)控了各個(gè)領(lǐng)域的所有細(xì)胞生命活動(dòng)的發(fā)生，在哺乳動(dòng)物中可能負(fù)責(zé)調(diào)控約50%的編碼基因[8]。在病毒感染和宿主天然免疫中，miRNA 也發(fā)揮著重要作用，參與病毒與宿主的互作，一方面，宿主miRNA可以作用于病毒基因組RNA抑制病毒增殖[5，9]，另一方面，病毒釋放的miRNA可作用于宿主基因抑制天然免疫[10-11]。

在前期工作中，筆者利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選獲得了3個(gè)可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因3′非翻譯區(qū)的miRNA，分別為 miR-181、miR-23、miR-4262[12]，本研究將進(jìn)一步分析其對[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)調(diào)控效應(yīng)及對PRRSV感染增殖的抑制效果，為進(jìn)一步獲得抗PRRSV增殖的功能miRNA奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

[HTK]1.1細(xì)胞和病毒[HT]

Marc-145細(xì)胞系，來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（購自HyClone）于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PRRSV-WUH3毒株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)分離保存，用于細(xì)胞感染試驗(yàn)。endprint

1.2miRNA模擬物和抑制物

miRNA模擬物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司人工合成，其序列如表1所示。

1.3miRNA模擬物轉(zhuǎn)染和PRRSV感染

轉(zhuǎn)染24 h前，消化Marc-145細(xì)胞，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)/孔細(xì)胞進(jìn)行均勻地鋪板，細(xì)胞長滿80%的計(jì)數(shù)板時(shí)開始轉(zhuǎn)染。各miRNA模擬物按一定濃度（20、50、60、100 nmol/L）稀釋后與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（購自Invitrogen）共孵育制備混合液，將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞或細(xì)胞上清液，進(jìn)行病毒感染。同時(shí)設(shè)置各種對照，Mock組為轉(zhuǎn)染空白對照組，僅加入了轉(zhuǎn)染試劑處理細(xì)胞，為轉(zhuǎn)染miRNA模擬物；NC組為miR-NC模擬物陰性對照組；NTC組為病毒感染空白對照組，采用PBS處理細(xì)胞。

1.4PRRSV感染

接種病毒前，先將病毒原液置于冰上慢慢融化。Marc-145轉(zhuǎn)染24 h后，用PRRSV-WUH3感染細(xì)胞[感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1]，感染24 h后收集細(xì)胞或細(xì)胞上清液。

1.5RNA提取及RT-PCR

細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液總RNA采用Trizol（購自Invitrogen）提取。反轉(zhuǎn)錄采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（購自Thermo Scientific），熒光定量PCR采用SYBR Select Master Mix for CFX（購自Applied Biosystems）染料，相對定量PCR采用GAPDH基因做內(nèi)參。病毒RNA的絕對定量，采用含有PRRSV病毒基因組片段（138 bp）的pMD-18T載體（購自TaKaRa）作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次。定量PCR所用引物的詳細(xì)信息如表2所示。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

[JP2]數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Students t檢測統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，P<0.05、P<0.01分別表示差異達(dá)到顯著、極顯著水平。[JP]

2結(jié)果與分析

2.1調(diào)控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達(dá)的miRNA驗(yàn)證

在前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-181、miR-23、miR-4262均可靶向與[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的3′非翻譯區(qū)結(jié)合[12]，為了驗(yàn)證這3個(gè)miRNA是否能調(diào)控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因 mRNA表達(dá)，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-181c、miR-23b、miR-4262的模擬物在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)各miRNA，檢測[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達(dá)量的變化情況，進(jìn)一步驗(yàn)證候選miRNA對[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的靶向調(diào)控作用。由圖1可知，與轉(zhuǎn)染空白對照組相比，轉(zhuǎn)染不同濃度梯度（20、50、100 nmol/L）的miR-181c、miR-4262均可極顯著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ][JP2]基因 mRNA表達(dá)量（P<0.01），而只有轉(zhuǎn)染高濃度劑量（100 nmol/L）的miR-23b才能顯著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)（P<0.05）。轉(zhuǎn)染各濃度梯度的陰性對照miR-NC組的[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因 mRNA表達(dá)水平與空白對照Mock組無顯著差異（P>0.05）?？梢妋iR-181、miR-4262均可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因抑制其mRNA表達(dá)，且miR-4262的抑制效果最佳。[JP][FL）]

[FK（W12][TPWJJ1.tif][FK）]

[FL（2K2]2.2miRNA抑制病毒增殖的效應(yīng)檢測

[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]是PRRSV感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體，而miR-181、miR-4262又可在一定程度上抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)，因此，進(jìn)一步在Marc-145細(xì)胞中檢測了miRNA抑制病毒增殖的效應(yīng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染60 nmol/L的各miRNA模擬物24 h后，再用PRRSV感染（MOI=0.1），感染24 h后分別檢測細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中PRRSV RNA的含量。由圖2、圖3可知，與轉(zhuǎn)染陰性對照NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-181c、miR-23b、miR-4262均能極顯著地抑制細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中的PRRSV RNA含量（P<0.01），其中miR-4262的抑制效果最好，可使細(xì)胞內(nèi)病毒含量下降87%。

3討論與結(jié)論

研究表明，miRNA在病毒與宿主的互作中扮演著重要的

[FK（W11][TPWJJ2.tif][FK）]

[FK（W11][TPWJJ3.tif][FK）]

角色，它們可以靶向作用病毒入侵的細(xì)胞關(guān)鍵因子[13-14]，或是直接作用于病毒基因組[15-16]。鑒于PRRSV入侵靶細(xì)胞必須依賴宿主細(xì)胞的特異性受體表達(dá)這一典型生物學(xué)特性，從[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]這個(gè)關(guān)鍵受體入手，篩選鑒定獲得調(diào)控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)的miRNA，從而找到抑制PRRSV感染增殖的功能miRNA。在前期的研究工作中，通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-181c、miR-23b、miR-4262均可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因[12]，本研究進(jìn)一步證實(shí)miR-181c、miR-23b、miR-4262均可顯著抑制PRRSV在細(xì)胞中復(fù)制增殖，但是這3個(gè)miRNA抗PRRSV增殖的分子機(jī)制可能不完全相同。endprint

2013年，Guo等首次發(fā)現(xiàn)miR-181可以直接作用于PRRSV基因組RNA，使病毒基因組降解發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[17]。同年，Gao等研究發(fā)現(xiàn)miR-181可以靶向作用受體基因[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的3′UTR，抑制受體基因[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的表達(dá)，從而阻止PRRSV增殖[18]，本研究結(jié)果與之相符。但是，值得關(guān)注的一個(gè)問題是本研究發(fā)現(xiàn)miR-4262、miR-181c對[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA水平抑制效果相當(dāng)（圖1），但是miR-4262對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞液中釋放的病毒含量的抑制效果卻顯著高于miR-181c（P<0.05），這暗示著這2個(gè)miRNA抑制PRRSV的分子機(jī)制并不完全相同。通過生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，miR-4262 除了可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因外，還能靶向調(diào)控另外一個(gè)PRRSV的關(guān)鍵受體基因[WTBX][STBX]CD169[WTBZ][STBZ]。miR-4262可能可以同時(shí)靶向作用[WTBX][STBX]CD163、CD169[WTBZ][STBZ]這2個(gè)PRRSV的關(guān)鍵受體基因，進(jìn)而提高了阻斷PRRSV增殖的能力；另外一個(gè)原因可能是 miR-4262還參與調(diào)節(jié)天然免疫信號通路，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，從而提高抗病毒增殖效應(yīng)。在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 60 nmol/L 的miR-4262，同時(shí)用 5 μg/mL Poly（I ∶[KG-*3]C）（聚肌苷酸胞苷酸，購自InvivoGen公司）處理，15 h后用MOI=0.1劑量的PRRSV感染24 h，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染miR-NC對照組相比，過表達(dá)miR-4262可顯著上調(diào)Ⅰ型干擾素IFN-α、IFN-β的表達(dá)，說明miR-4262可一定程度解除PRRSV對Ⅰ型干擾素的抑制，然而具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

轉(zhuǎn)染低濃度劑量（20、50 nmol/L）的miR-23b并不顯著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA的表達(dá)，即使是轉(zhuǎn)染100 nmol/L劑量的miR-23b也只能抑制11%的[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達(dá)量（圖1），然而miR-23b卻能大幅度抑制PRRSV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與病毒的釋放（圖2、圖3）。因此，miR-23b的抗PRRSV增殖效應(yīng)并不是通過抑制受體[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因?qū)崿F(xiàn)的。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV基因組RNA中含有miR-23b的作用靶點(diǎn)，表明miR-23b可能與PRRSV RNA靶向結(jié)合抑制病毒增殖[19]。同時(shí)，Zhang等還發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后，miR-23 能通過激活I(lǐng)RF3/IRF7誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，進(jìn)一步抑制病毒感染[19]。

PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，入侵靶細(xì)胞依賴宿主細(xì)胞上特異性受體的表達(dá)，而[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]就是PRRSV入侵的一個(gè)關(guān)鍵受體基因。在獲得靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的miRNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在細(xì)胞水平證實(shí)了miR-181c、miR-23b、miR-4262具有抑制PRRSV增殖的效應(yīng)，其中miR-4262抑制效果最佳。3個(gè)miRNA抑制PRRSV增殖的分子機(jī)制不盡相同。miR-181c是同時(shí)通過靶向作用PRRSV基因組RNA和抑制PRRSV關(guān)鍵受體[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]發(fā)揮抗病毒作用；miR-4262是通過靶向抑制PRRSV關(guān)鍵受體[WTBX][STBX]CD163和CD169[WTBZ][STBZ]，同時(shí)參與誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素抑制病毒增殖；miR-23b則可能是直接通過激活I(lǐng)RF3/IRF7誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素抑制病毒感染。本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用，其具體分子作用機(jī)制還有待更進(jìn)一步的深入研究。

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