王健勝+侯桂玲+謝永鳳

摘要：采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記對19份國內(nèi)外苜蓿種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，7對RAPD引物在供試苜蓿材料中共獲得有效擴(kuò)增位點(diǎn)51個，其中多態(tài)性位點(diǎn)50個，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為98.04%。引物的有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)、Shannons信息指數(shù)和多態(tài)性信息含量平均分別為1.48個、0.29、0.44和0.33。供試苜蓿材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.039～0.922之間，平均為0.494。聚類分析和主成分分析均表明，供試苜蓿種質(zhì)可被劃分為兩大類，其中第一類群包括的苜蓿種質(zhì)數(shù)最多，達(dá)到16個，占所有供試苜蓿種質(zhì)數(shù)的84.21%。研究結(jié)果將為供試苜蓿種質(zhì)有效利用提供一定科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苜蓿；遺傳多樣性；RAPD分析

中圖分類號： S551+.703文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0035-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-15

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：KJT142102110171）；河南省平頂山市科技計(jì)劃（編號：2014086）。

作者簡介：王健勝（1978—），男，陜西禮泉人，博士，講師，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：wjsheng1998@163.com。

[ZK）]

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生同源四倍體（2n=4x=32）和異花授粉植物，也是世界上最重要的豆科牧草之一，被譽(yù)為“牧草之王”[1]。紫花苜蓿在我國的栽培歷史較長，其栽培面積也是牧草中最大的。近年來，隨著人們對苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的逐步重視，我國不斷加強(qiáng)了國外苜蓿引種和種質(zhì)資源交流，這為我國苜蓿相關(guān)研究提供了較為豐富的種質(zhì)資源。但是，引種和品種資源交流頻率的增加造成了現(xiàn)有苜蓿品種在名稱和來源上的混亂，品種及種質(zhì)的產(chǎn)權(quán)問題、種子質(zhì)量問題也越來越嚴(yán)重，而且至今未能建立起有效的鑒別方法和標(biāo)準(zhǔn)，這也在一定程度上限制了優(yōu)良種質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)利用。因此，開展苜蓿種質(zhì)資源研究顯得尤其重要。

分子標(biāo)記技術(shù)作為重要研究手段在植物種質(zhì)資源研究中得到了極為廣泛的應(yīng)用，但與其他主要農(nóng)作物相比，利用分子標(biāo)記開展苜蓿種質(zhì)資源的研究仍較少。由于苜蓿分子標(biāo)記研究起步較晚，導(dǎo)致苜蓿專有分子標(biāo)記開發(fā)數(shù)量較少，因此現(xiàn)有苜蓿研究中利用的分子標(biāo)記主要以隨機(jī)標(biāo)記為主。目前，包括擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）[2]、微衛(wèi)星（SSR）[3-4]、微衛(wèi)星間隔（ISSR）[5-6]等多種類型分子標(biāo)記都較好地被應(yīng)用于苜蓿種質(zhì)資源研究中。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記是一種較早開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，由于它具有易擴(kuò)增、多態(tài)性高、操作簡便、無種屬限制等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于苜蓿遺傳多樣性研究中[7-9]。因此，本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對國內(nèi)外的19份苜蓿栽培種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，在初步掌握不同苜蓿種質(zhì)間親緣關(guān)系的同時， 發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良變異的苜蓿種質(zhì)，為我國苜蓿種質(zhì)的科學(xué)鑒定、保護(hù)和高效利用提供一定的基礎(chǔ)。

1材料與方法

[HTK]1.1試驗(yàn)材料[HT]

供試材料基本信息見表1。

1.2DNA提取

每份材料隨機(jī)選取10～15個單株幼嫩葉片等量混合，采用改良的十二烷基硫酸鈉（SDS）法[10]混合提取基因組總DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定濃度后，稀釋至適合濃度用于苜蓿基因組PCR擴(kuò)增檢測。

1.3RAPD標(biāo)記檢測

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上完成。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括1.5 μL基因組DNA（40 ng），1.5 μL引物（20 mmol/L），2.0 μL10×PCR緩沖液（含Mg2+），2.0 μL 底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和12 μL ddH2O。本研究用的RAPD引物相關(guān)信息見表2。

RAPD-PCR擴(kuò)增程序：3個循環(huán)（94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min）；37個循環(huán)（94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min）； 最后72 ℃ 5 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為 1.8% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)上保存分析，同時為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個RAPD反應(yīng)都需要重復(fù)3次以上。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

以0、1、9統(tǒng)計(jì)SCOT擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10軟件通過非加權(quán)平均法（UPMGA）計(jì)算苜蓿種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并在此基礎(chǔ)上作聚類分析及主要成分分析。采用POPGEN32軟件估算SCOT標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)，包括引物擴(kuò)增總條帶數(shù)（TNB）、多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）、多態(tài)性條帶百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）。

2結(jié)果與分析

2.1苜蓿種質(zhì)RAPD多態(tài)性分析

利用篩選出的多態(tài)性表現(xiàn)較好的7個RAPD引物對苜蓿種質(zhì)群體進(jìn)行了檢測分析。由表3可見，不同RAPD引物對苜?；蚪M的擴(kuò)增存在較大差異，單個RAPD引物擴(kuò)增條帶數(shù)分布在3～12個，平均為7.29個，多態(tài)性條帶數(shù)分布在 2～12個，平均為5.14個。在所利用的RAPD引物中，除OPA13外，其余引物的多態(tài)性條帶百分率均為100.00%，所有引物多態(tài)性條帶百分率平均達(dá)到了95.24%。不同標(biāo)記間的遺傳參數(shù)差異也較大。有效等位基因數(shù)分布在1.32～167個，平均為1.48個；Neis基因多樣性指數(shù)的分布范圍是0.23～0.38，平均為 0.29；所有引物的Shannons信息指數(shù)都較高，其分布范圍在0.38～0.55，平均為0.44。多態(tài)性信息含量是衡量分子標(biāo)記有效性的重要指標(biāo)之一，從表3不難看出，不同RAPD標(biāo)記的多態(tài)性信息含量差異較大，其分布范圍在0.23～0.41，平均為0.33。endprint

2.2不同苜蓿種質(zhì)親緣關(guān)系分析

由表4可見，不同苜蓿種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)差異較大。苜蓿種質(zhì)3與15間的遺傳相似系數(shù)最小，只有0.039，表明這2個苜蓿種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；種質(zhì)6與7間的遺傳相似系數(shù)最大，達(dá)到了0.922，表明與其他苜蓿種質(zhì)相比，這2個苜蓿種質(zhì)間具有較近的親緣關(guān)系。同時可以看出，所有苜蓿種質(zhì)平均遺傳相似系數(shù)較低，只有0.494，表明供試苜蓿種質(zhì)整體遺傳差異水平較高，在未來苜蓿遺傳育種相關(guān)研究中具有較好的利用前景。

2.3不同苜蓿種質(zhì)聚類分析

基于RAPD標(biāo)記檢測獲得的遺傳相似系數(shù)對19份苜蓿種質(zhì)進(jìn)行了聚類分析，由圖1可知，19份苜蓿種質(zhì)在遺傳系數(shù)0.420處可被劃分為2個大類，第1類群包括的苜蓿種質(zhì)數(shù)最多，達(dá)到了16個，占供試苜蓿種質(zhì)總數(shù)的84.21%，其中國內(nèi)苜蓿種質(zhì)11個，國外苜蓿種質(zhì)5個；第2類群包含的苜蓿種質(zhì)數(shù)只有3個，均來自國內(nèi)，系數(shù)分別是0.844 0、0.844 3 和0.844 6。根據(jù)第1類群中苜蓿種質(zhì)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，該類群在遺傳相似系數(shù)0.573處又可劃分為2個亞群，第1亞群共包括8個苜蓿種質(zhì)，其中有3個國外種質(zhì)，5個國內(nèi)種質(zhì)，第2亞群也由8個苜蓿種質(zhì)構(gòu)成，除賽迪7和游客外，其余均為國內(nèi)苜蓿種質(zhì)。

2.4苜蓿種質(zhì)主成分分析[HT]

以RAPD標(biāo)記檢測數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對19份苜蓿種質(zhì)進(jìn)行了主成分分析，具體分析結(jié)果見圖2。在主成分分析中，前3個主成分能解釋的總遺傳變異較高，達(dá)50.99%。從圖2可以看出，主成分分析獲得了與聚類分析完全一致的結(jié)果，聚類分析中被聚為同一類群的苜蓿種質(zhì)在主成分分析中也被劃分為一類，由此可見，主成分分析結(jié)果也在一定程度上準(zhǔn)確反映了不同苜蓿種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

3討論

苜蓿種質(zhì)資源研究一直備受重視[11-12]，利用不同類型的分子標(biāo)記，許多學(xué)者對不同苜蓿種質(zhì)資源開展了較多的研究，其中RAPD標(biāo)記是應(yīng)用最早且應(yīng)用頻率較高的分子標(biāo)記之一。為了獲得苜?；蚪M理想的擴(kuò)增效果，袁慶華等針對RAPD反應(yīng)條件進(jìn)行了專門的優(yōu)化篩選探索[13-15]，這些研究結(jié)果也進(jìn)一步促進(jìn)了RAPD在苜蓿研究中的有效應(yīng)用。本研究利用多態(tài)性表現(xiàn)良好的RAPD標(biāo)記對19份國內(nèi)外苜蓿種質(zhì)進(jìn)行了分析，7個RAPD標(biāo)記共獲得51個有效擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)50個，多態(tài)性位點(diǎn)百分率達(dá)到 98.04%。楊曉莉等利用10個RAPD引物在11個苜蓿栽培品種中擴(kuò)增獲得了811%的多態(tài)性位點(diǎn)百分率[16]，蒿若超等用35個RAPD引物對53份苜蓿進(jìn)行分析，獲得的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為9412%[17]，王赫等在利用RAPD引物進(jìn)行苜蓿種質(zhì)多樣性分析中僅獲得了74.5%的多態(tài)性位點(diǎn)百分率[18]。通過比較不難看出，不同研究中RAPD標(biāo)記對苜?；蚪M的擴(kuò)增效果差異較大，而本研究獲得的多態(tài)性位點(diǎn)百分率相對最高，究其原因，除了不同研究中利用的RAPD標(biāo)記序列不同外，苜蓿種質(zhì)的差異也是重要影響因素之一。[JP]

分子標(biāo)記應(yīng)用中多樣性參數(shù)分析不僅有利于我們掌握分子標(biāo)記對苜蓿基因組檢測的有效性，同時也能在一定程度上反映所研究苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性狀況。在以往的利用RAPD標(biāo)記進(jìn)行苜蓿種質(zhì)遺傳多樣性研究中，有關(guān)RAPD標(biāo)記多樣性參數(shù)分析的報(bào)道甚少。本研究對所利用的RAPD標(biāo)記的4種主要多樣性參數(shù)作了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAPD標(biāo)記的主要多樣性參數(shù)表現(xiàn)均較好，其中有效等位基因數(shù)平均為1.48個，Neis 基因多樣性指數(shù)平均為0.29，Shannons信息指數(shù)平均為0.44，多態(tài)性信息含量平均為0.33。

以RAPD標(biāo)記檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，本研究對供試苜蓿種質(zhì)的遺傳多樣性及親緣關(guān)系作了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試苜蓿種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富，其平均遺傳相似系數(shù)只有0.494，在聚類分析中，19份苜蓿種質(zhì)可被劃分為2個大類，該聚類分析結(jié)果已經(jīng)清楚地反映了不同苜蓿種質(zhì)間親緣關(guān)系的狀況。在未來苜蓿種質(zhì)資源利用中，我們應(yīng)當(dāng)以此為基礎(chǔ)，選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn)、農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好且互補(bǔ)的苜蓿種質(zhì)作為育種親本配制雜交組合，只有這樣，才能有效提高苜蓿優(yōu)良新品種培育的效率和水平。

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