劉政澤+劉博

摘要：對14個藤黃屬物種26份樣品的ITS和matK進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，應(yīng)用Kimura 2-parameter遺傳距離與最大似然法（ML）和鄰接（NJ）系統(tǒng)樹分析法進(jìn)行分析，旨在研究其種間親緣關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有藤黃屬樣品分為四大支且能明顯分開，顯示出該屬植物的親緣關(guān)系。分布于亞洲和美洲的物種能夠分開，表明不同的地理環(huán)境造成了不同的進(jìn)化方向。木竹子和菲島福木在我國有較高的遺傳多樣性。ITS+matK序列分析可作為藤黃屬植物親緣關(guān)系鑒定的手段。

關(guān)鍵詞：藤黃屬；DNA條形碼；ITS；matK；親緣關(guān)系

中圖分類號： Q789文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0039-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-02-24

基金項(xiàng)目：歐盟第七框架項(xiàng)目（編號：PIRSES-GA-2009-269204）。

作者簡介：劉政澤（1991—），男，湖北十堰人，碩士研究生，從事藤黃屬植物親緣關(guān)系和分子鑒定研究。Email：liuzhengze1991@163.com。

通信作者：劉博，博士，講師，從事民族植物學(xué)與植物資源學(xué)研究。E-mail：boliu@muc.edu.cn。

[ZK）]

藤黃屬（Garcinia）植物是藤黃科（Clusiaceae）喬木或灌木，全世界約450種，主要分布在熱帶亞洲、非洲南部及波利尼西亞西部。我國有21種，其中13種為特有種，產(chǎn)于臺灣南部，福建，廣東，海南，廣西南部，云南南部、西南部至西部，西藏東南部，貴州南部及湖南西南部[1]。

藤黃屬植物有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。莽吉柿（G. mangotana Linn.）是一種著名的熱帶水果，被稱為“熱帶水果皇后”[2]。本屬植物富含天然苯甲酮成分，具有很好的抗菌、抗病毒、抗細(xì)胞毒素、抗HIV和抗真菌活性特性[3]，現(xiàn)代藥理學(xué)證明，部分藤黃屬植物具有潛在的治療HIV[4]和癌癥[5]的能力。Burkill 1966年在《馬來半島經(jīng)濟(jì)作物》一書中記載了藤黃屬植物可用于產(chǎn)后恢復(fù)，治療痛經(jīng)、痢疾和發(fā)燒。

在我國，藤黃屬植物也有很廣泛的用途，如傣族、黎族等長期采摘大葉藤黃（G. xanthochymus Hook. f. ex T. Anders.）、嶺南山竹子（G. oblongifolia Champ. ex Benth.）和版納藤黃（G. xipshuanbannaensis Y. H. Li）的果實(shí)當(dāng)作水果和食物調(diào)料。中藥藤黃是我國的傳統(tǒng)藥材，中醫(yī)用其治療癰疽腫毒、潰瘍、濕瘡、腫瘤、頑癬、跌打損傷、創(chuàng)傷出血及燙傷等[6]。金絲李（G. paucinervis Chun et How）是我國二級保護(hù)植物和珍貴的用材樹種[7]。木竹子（G. multiflora Champ. ex Benth.）和嶺南山竹子因其種子含油，可用于制作肥皂和機(jī)械潤滑油。藤黃屬植物也是重要的觀賞植物，如大葉藤黃和木竹子都有很高的觀賞價(jià)值，常被用作園林樹木[8-9]。菲島福木（G. subelliptica Merr.）是我國沿海地區(qū)營造防風(fēng)林的理想樹種。

由于藤黃屬植物具有重要的價(jià)值，研究其種間親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育，為今后廣泛地栽培利用提供基礎(chǔ)資料很有必要。DNA條形碼是用一段短的標(biāo)準(zhǔn)的序列對物種進(jìn)行鑒定的新方法，具有快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)的特點(diǎn)，為物種的鑒定和親緣關(guān)系的研究提供了新思路[10]。

在真核生物中，核糖體DNA中的18S、5.8S和28S的基因組序列在大多數(shù)生物中趨于保守，在生物種間變化小，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，承受的選擇壓力較小，相對變化較大，并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學(xué)分析所需要的可遺傳性狀，因此被廣泛用于植物分類學(xué)研究中[11-12]。Yapwattanaphum等學(xué)者在先前的研究中已使用ITS序列探求部分東南亞藤黃屬物種間的親緣關(guān)系[2，13]。matK基因位于葉綠體trnK基因的內(nèi)含子中，編碼一種參與RNA轉(zhuǎn)錄體中Ⅱ型內(nèi)含子剪切的成熟酶（matuease），是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)進(jìn)化最快的基因之一，其核苷酸變化也可為種間系統(tǒng)進(jìn)化研究提供一定的信息。本研究基于matK和ITS序列[14-15]，探討藤黃屬的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育問題。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用材料取自野外和植物園，共16個物種28份樣品，其中藤黃屬樣品14種26份（5種在中國有分布），選取藤黃科它屬植物Mammea sessiliflora和Mesua ferrea作為外類群（表1）。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取

使用改良后的CTAB法提取經(jīng)硅膠干燥的葉片總DNA[16]。

1.2.2DNA序列的擴(kuò)增和測序

（1）ITS序列的擴(kuò)增。參考White等的方法[17]使用引物ITS-4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）和ITS-5（5′-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3′）擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2完整序列。PCR反[CM（25]應(yīng)體系為[KG*5]25[KG*3]μL，包括DNA模板1.0 μL（10[KG*3]ng）、2×DNA純化和測序工作由北京鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3DNA數(shù)據(jù)的整理

使用MEGA 6.0對導(dǎo)入的序列進(jìn)行對位排列（alignment），進(jìn)一步手動校對和調(diào)整；ITS及matK序列的頭和尾參照Genbank上已有的相關(guān)系列確定；各片段的GC含量通過DNAstar Lasergene計(jì)算；序列的變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)和保守位點(diǎn)個數(shù)由MEGA 6.0確定。endprint

1.3親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGA 6.0計(jì)算ITS+matK序列的種間Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，數(shù)據(jù)采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和鄰接法（neighbor-joining，NJ）分析。其中鄰接法分析采取K2P距離法，進(jìn)行1 000次自展重復(fù)檢測支持率；最大似然法通過Modeltest確定最適模型（Kimura 2-parameter + Gamma distributed），自展數(shù)據(jù)值為1 000次，以提高樹中分枝的置信度[19]。

2結(jié)果與分析

2.1序列測定結(jié)果

測序得到ITS、matK序列56條，將其在NCBI上進(jìn)行BLAST相似性檢索，均有較好的匹配程度，確認(rèn)所測序列為目標(biāo)序列，檢索比對結(jié)果表明測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2序列分析

在序列長度方面，ITS（615～623 bp）略短于matK（699～715 bp）。在序列GC含量上，matK和ITS明顯不同，matK只有30.68%，而ITS高達(dá)51.63%。ITS有251個變異位點(diǎn)，matK相對較少，變異位點(diǎn)數(shù)為114個（表2）。

2.3K2P遺傳距離

ITS+matK序列的種間K2P遺傳距離為0.004 6～0.191 8，平均遺傳距離為0.076 3（表3）。其中，嶺南山竹子和云樹間的遺傳距離最小，為0.004 6；菲島福木和莽吉柿間的遺傳距離最大，為0.191 8。

2.4親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS+matK序列以M. sessiliflora和M. ferrea作為外類群，通過最大似然法（ML）和鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1、圖2）。2種不同方法所構(gòu)建的發(fā)育樹結(jié)構(gòu)基本一致，且能將本研究涉及的14種藤黃屬樣品區(qū)分開。所有樣品[FL）]共聚類為四大支且主要集中于兩大支，木竹子和G. rostrata分別[CM（25]自成一支。2種建樹結(jié)果支持云樹和嶺南山竹子歸為一支[JP][CM）]

[FK（W21][TPLZZ222.tif][FK）]

（自展支持率分別為99%和100%）；莽吉柿和G. penangiana、G. hombroniana、G. scortechinii等東南亞種親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)發(fā)育樹支持G. madruno和G. intermedia為一小支（自展支持率均為100%），這與其均產(chǎn)自熱帶美洲相吻合。菲島福木、G. nervosa和G. madruna此3種亞洲物種與G. madruno和G. intermedia美洲物種聚為一支。

3討論與結(jié)論

28份樣品均成功擴(kuò)增出ITS和matK片段，擴(kuò)增成功率100%。基于ITS+matK序列信息建樹，能將所有樣品區(qū)分開，說明ITS+matK序列可以為藤黃屬物種的系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系研究提供足夠的變異信息。和前人研究一致，matK序列相對于ITS序列較為保守，進(jìn)化速度較慢。

在系統(tǒng)發(fā)育樹中，分布于亞洲和美洲的藤黃屬物種基本能夠分開，說明不同的地理環(huán)境使其產(chǎn)生了不同的進(jìn)化方向。而木竹子和G. rostrata自成一支，則需要進(jìn)一步的研究或使用其他DNA條形碼探究其與其他物種之間的關(guān)系。菲島福木、G. nervosa和G. madruna此3種亞洲物種與美洲物種形成姐妹群，它們在藤黃屬系統(tǒng)進(jìn)化中的地位仍需更多的研究來確定。采自不同省份的木竹子和菲島福木在其種內(nèi)表現(xiàn)出遺傳差異，說明它們具有較高的遺傳多樣性，并且進(jìn)一步證明ITS+matK序列在藤黃屬內(nèi)有很好的鑒別能力。G. penangiana在嫁接中被當(dāng)作莽吉柿的砧木使用，在系統(tǒng)發(fā)育樹中它們也是近緣種。

單獨(dú)抽取系統(tǒng)發(fā)育樹中分布于中國的物種，將其與基于形態(tài)學(xué)的經(jīng)典分類法所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹相比較，展現(xiàn)了高度的相似性（圖3）。例如云樹和嶺南山竹子在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分，只能根據(jù)它們的果實(shí)性狀和子房數(shù)進(jìn)行分辨，本研究通過DNA條形碼技術(shù)同樣支持這一結(jié)果，其遺傳距離最小只有0.004 6。這一結(jié)果在一定程度上反映了經(jīng)典分類系統(tǒng)的可靠性。

[FK（W8][TPLZZ333.tif；S+2mm][FK）]

本研究利用ITS+matK序列通過DNA條形碼技術(shù)初步探究了部分藤黃屬植物的親緣關(guān)系，期望為該屬植物今后的開發(fā)利用提供必要的信息和數(shù)據(jù)。但是由于條件有限，所涉及物種較少，希望今后可以增加新材料，完善藤黃屬植物的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育研究。

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]中國科學(xué)院植物志編輯委員會. 中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1990：1-112.

[2]Yapwattanaphum C，Subhadrabandhu S，Honsho C，et al. Phylogenetic relationship of mangosteen（Garcinia mangostana）and several wild relatives（Garcinia spp.） revealed by ITS sequence data[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2004，129（3）：368-373.

[3]Wu S B，Long C L，Kennelly E J. Structural diversity and bioactivities of natural benzophenones[J]. Natural Product Reports，2014，31（9）：1158-1174.

[4]Rukachaisirikul V，Pailee P，Hiranrat A，et al. Anti-HIV-1 protostane triterpenes and digeranylbenzophenone from trunk bark and stems of Garcinia speciosa[J]. Planta Medica，2003，69（12）：1141-1146.endprint

[5]Nabandith V，Suzui M，Morioka T，et al. Inhibitory effects of crude alpha-mangostin，a xanthone derivative，on two different categories of colon preneoplastic lesions induced by 1，2-dimethylhydrazine in the rat[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2004，5（4）：433-438.

[6]王鳴，馮煦，趙友誼，等. 中藥藤黃的研究和應(yīng)用[J]. 中國野生植物資源，2003，22（1）：1-4.

[7]王才明，黃仕訓(xùn)，王燕. 廣西國家級珍稀瀕危保護(hù)植物種質(zhì)資源調(diào)查研究[J]. 廣西植物，1994，14（3）：277-288.

[8]和太平，文祥鳳. 優(yōu)良的鄉(xiāng)土園林樹種——大葉山竹子[J]. 西南園藝，2005，33（3）：39-39.

[9]Zhang，B X，Liu B，Zhou Y，et al. Potential ornamental plants in Clusiaceae of China[J]. Acta Horticulturae，201（1087）：233-238.[ZK）]

[10][ZK（#]劉宇婧，劉越，黃耀江，等. 植物DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（1）：74-82，93.

[11]盧松茂，陳振東，林秀香，等. 基于rDNA-ITs序列的天門冬擬莖點(diǎn)霉與相似種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（1）：62-67. [HJ1.7mm]

[12]魏莎莎，傅怡寧，薛華杰，等. 基于ITS序列的曼陀羅屬植物的分類學(xué)研究[J]. 植物檢疫，2011，25（5）：12-16.

[13]Nazre M，Latif A，Clyde M M. Phylogenetic relationships of locally cultivated Garcinia species with some wild relatives[J]. Malaysian Applied Biology，2007，36（1）：31-40.

[14]馮媛媛，夏珊，曾其國，等. 基于ITS序列對紫薇的分子鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：67-69.

[15]蔣向輝，劉良科，佘朝文. 葛屬11份種質(zhì)基于核rDNAITS序列的親緣關(guān)系分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：46-49.

[16]Doyle J. Isolation of plant DNA from fresh tissue[J]. Focus，1990（12）：13-15.

[17]White J T，Bruns T，Lee S B，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. PCR protocols：a guide to methods and applications. Florida：Academic Press，1990：335.

[18]王亞玲，李勇，張壽洲，等. 用matK序列分析探討木蘭屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，2006，44（2）：135-147.

[19]Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies：an approach using the bootstrap[J]. Evolution，1985，39（4）：783-791.endprint