劉笑塵++高爽+許偉+戴良英

摘要：反式-4-羥脯氨酸為手性亞氨基酸，是一種被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、美容、化工、畜牧領(lǐng)域的生產(chǎn)原料。通過以下工作構(gòu)建了1株能夠高效表達(dá)反式-4-脯氨酸羥化酶基因的重組大腸桿菌：（1）使用JCAT軟件優(yōu)化反式-4-脯氨酸羥化酶的編碼區(qū)基因序列，改變141個堿基（替換了138個同義密碼子），使其CAI指數(shù)由0.396 5優(yōu)化至 0.927 7，C/G由73.626 3%優(yōu)化至59.706 9%，優(yōu)化mRNA延伸效率；（2）優(yōu)化非編碼區(qū)序列，選擇色氨酸啟動子并進(jìn)行簡化，使RBS區(qū)包含SD序列，在RBS區(qū)前添加g10-L翻譯增強(qiáng)子，使用RNAstructure軟件優(yōu)化起始區(qū)序列的二級結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)mRNA的起始效率；（3）構(gòu)建重組大腸桿菌DH5α/pUC-19-pH，優(yōu)化宿主及質(zhì)粒載體，最終得到的重組菌DH5α/pUC-19-pH比酶活達(dá)到0.010 8 U/mg。

關(guān)鍵詞：反式-4-羥脯氨酸；重組大腸桿菌；起始效率；延伸效率；優(yōu)化

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0019-05[HS）][HT9.SS]

[HJ1.4mm]

收稿日期：2016-03-19

基金項目：湖南省現(xiàn)代柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（編號：2015137）。

作者簡介：劉笑塵（1990—），男，湖南武岡人，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵和植物與微生物分子互作研究。E-mail：373709368@qq.com。

通信作者：許偉，博士，主要從事微生物發(fā)酵研究，E-mail：49385395@qq.com；戴良英，博士，教授，主要從事植物與微生物分子互作研究，E-mail：daily@hunau.net。[HJ]

[ZK）]

羥基脯氨酸（Hyp）是一種手性亞氨基酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、美容、化工、畜牧等領(lǐng)域[1]。最初人們通過水解哺乳動物的膠原蛋白[2]來獲取反式-4-羥脯氨酸，但此法有許多弊端[3]。

1999年，研究人員篩選得到指孢囊菌RH1，從該菌中提取到能高效表達(dá)的反式-4-脯氨酸羥化酶，并獲得反式-4-脯氨酸羥化酶基因序列，之后該研究團(tuán)隊又將獲得的基因序列和脯氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶基因成功導(dǎo)入大腸桿菌質(zhì)粒中獲得重組工程菌，在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵體系中，發(fā)酵4 d后可得25 g/L的反式-4-羥脯氨酸，大大提高了反式-4-羥脯氨酸的發(fā)酵效率[4-6]。日本協(xié)和發(fā)酵生物技術(shù)公司也確立了反式-4-羥脯氨酸的高效微生物發(fā)酵生產(chǎn)法[7]。

但該技術(shù)在國內(nèi)仍有待優(yōu)化。本研究為構(gòu)建1株能夠高效表達(dá)反式-4-脯氨酸羥化酶基因的重組大腸桿菌，嘗試優(yōu)化反式-4-脯氨酸羥化酶的編碼區(qū)基因序列，并通過添加g10-L翻譯增強(qiáng)子、SD序列、優(yōu)化mRNA起始區(qū)二級結(jié)構(gòu)、簡化色氨酸啟動子等方式進(jìn)行試驗，最后對質(zhì)粒載體和宿主菌的選擇進(jìn)行優(yōu)化，以獲得發(fā)酵過程中比酶活最高的重組菌。

1材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

本研究所采用的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.2反式-4-脯氨酸羥化酶比酶活的測定

將標(biāo)準(zhǔn)反式-4-羥脯氨酸溶液稀釋25倍得濃度為 4 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其D560 nm，對重組大腸桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理后，測定發(fā)酵液的D560 nm、D600 nm，繪制反式-4-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式（1）計算重組菌細(xì)胞干質(zhì)量。

[JZ（]DWC=0.54×D600 nm。[JZ）][JY]（1）

DCW單位為g/L。

發(fā)酵液12 000 r/min離心2 min，棄上清，回收菌體，將 500 μL 的酶反應(yīng)緩沖液（MES 240 mmol/L，pH值6.5，脯氨酸20 mmol/L，2-酮戊二酸40 mmol/L，硫酸亞鐵4 mmol/L，維生素C 8 mmol/L）加入到菌體中，將細(xì)胞重新懸浮，于 35 ℃ 搖床220 r/min培養(yǎng)15 min，轉(zhuǎn)移到100 ℃水浴中加熱2 min，采用氯胺T法測定反式-4-羥脯氨酸的濃度。

1個酶活性單位為1 min將1 nmol脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U；比酶活是1 mg干菌體的酶活性，單位為U/mg，推出計算公式（2）。

[JZ（]比酶活=0.094×D560 nm/D600 nm。[JZ）][JY]（2）

式中：D560 nm為反應(yīng)體系在560 nm波長處的吸光度。

1.3反式-4-脯氨酸羥化酶基因優(yōu)化

來源于指囊孢菌RH1[5]的反式-脯氨酸-4-羥化酶基因序列共819 bp，編碼272個氨基酸，RH1與優(yōu)化模板E.coli K12對比，最適密碼子所占比例差異較大，根據(jù)密碼子優(yōu)化策略，使用JCAT軟件優(yōu)化密碼子，排除出現(xiàn)終止子、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和RBS序列的可能，將RH1序列中稀有密碼子替換為最適密碼子。根據(jù)N-端規(guī)則[8]，將亮氨酸（Leu）突變?yōu)槔i氨酸（Val），避免序列對應(yīng)編碼的第2個氨基酸殘基為Leu，增長蛋白質(zhì)半衰期。

1.4非編碼區(qū)優(yōu)化

1.4.1g10-L翻譯增強(qiáng)序列

來源于T7噬菌體的g10-L翻譯增強(qiáng)序列由9個堿基組成（UUAACUUUA），其對外源基因的表達(dá)量有顯著的增強(qiáng)作用，可達(dá)40～340倍[9]，已知pET28a的一段RBS區(qū)如圖1所示，其內(nèi)部已包含了g10-L翻譯增強(qiáng)序列。

[CM（26]1.4.2SD序列SD序列通常由4～5個核苷酸組成，在原[CM）]

[FK（W3][TPLXC11.tif][FK）]

核生物核糖體與mRNA結(jié)合的時候，SD序列能幫助mRNA從起始處開始翻譯[10-11]，有研究表明，在測試中將SD序列與E.coli K12的基因組用SPSS軟件做CAI值和離散增量相關(guān)分析，以AAGGA為核心的SD序列為強(qiáng)SD序列[12]。圖2中下劃線為SD序列，陰影區(qū)域為SD序列的強(qiáng)核心，在SD序列前端的9個核苷酸則是T7 g10-L翻譯增強(qiáng)序列。有報道稱，將T7 g10-L序列置于表達(dá)質(zhì)粒的SD序列上游能有力地提高下游基因編碼蛋白的表達(dá)水平[13]。endprint

[FK（W3][TPLXC22.tif][FK）]

1.4.3mRNA翻譯起始區(qū)二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化

mRNA翻譯起始區(qū)（translation initiation region，TIR）由起始密碼子AUG前后數(shù)十個堿基組成，TIR中任何1個堿基的改變都有可能對其二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生巨大影響，從而改變mRNA翻譯過程中的起始效率[14-15]。TIR中序列若能形成穩(wěn)定且較長的二級結(jié)構(gòu)就會阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合效率，對翻譯的起始效率造成不利影響[16]，而自由能（ΔG）的高低則作為mRNA翻譯起始效率的評估指標(biāo)對TIR的優(yōu)化進(jìn)行指導(dǎo)[17]。

1.4.4啟動子優(yōu)化

為得到高產(chǎn)量的反式-4-羥基脯氨酸，須要獲得既有較高比酶活的反式-4-脯氨酸羥化酶，還要有能通過簡便有效的方法控制發(fā)酵的啟動子，而色氨酸啟動子能夠很好地滿足以上所述的調(diào)控需要[18]，本研究所用到的色氨酸啟動子由劉合棟的啟動子序列[19]精簡優(yōu)化而來。

1.4.5反式-4-脯氨酸羥化酶基因表達(dá)盒構(gòu)建

綜合 “1.3”節(jié)、“1.4”節(jié)中所述，在反式-4-脯氨酸羥化酶編碼基因序列的3′端添加來自PET載體的TrpLABCDE轉(zhuǎn)錄終止序列TAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTT，以保護(hù)序列的穩(wěn)定性。完整的表達(dá)盒交由上海生工生物工程有限公司合成，為了方便后續(xù)試驗，本研究在表達(dá)盒的5′端加入限制性內(nèi)切酶SalⅠ識別序列GTCGAC，在3′端加入限制性內(nèi)切酶NdeⅠ的酶切位點(diǎn)CATATG。

1.5重組菌DH5α/pUC19-pH的構(gòu)建

合成后的反式-4-脯氨酸羥化酶表達(dá)盒基因經(jīng)SalⅠ和NdeⅠ雙酶切后，鏈接到pUC19-T質(zhì)粒上，重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜如圖3所示。

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pUC-19-pH轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，得重組大腸桿菌DH5α/pUC-19-pH，將DH5α/pUC-19-pH于帶有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上涂板培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pUC-19-pH，重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和NdeⅠ雙酶切后，測序驗證2段序列的正確性。

1.6宿主菌優(yōu)化

將驗證后的pUC19-pH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至JM109、C43、BL21、XL-1感受態(tài)細(xì)胞中， 得重組大腸桿菌JM109/pUC19-pH、C43/pUC19-pH、BL21/pUC19-pH、XL-1/pUC19-pH。

將5株重組大腸桿菌涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上， 37 ℃培養(yǎng)12 h， 挑取陽性重組子。將4株陽

[FK（W13][TPLXC33.tif][FK）]

性重組子在盛有液體LB培養(yǎng)基的搖瓶（盛有30 mL培養(yǎng)基的 100 mL 三角瓶）中，37 ℃、220 r/min發(fā)酵12 h后，對發(fā)酵液進(jìn)行蛋白電泳檢測，同時測定干菌比酶活，對比數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.7質(zhì)粒載體優(yōu)化

將優(yōu)化后合成并通過驗證的表達(dá)盒連接到pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1、pCOLAduet-1載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，得重組菌DH5α/pCDFDuet-1-pH、DH5α/pACYCDuet-1-pH、DH5α/pETDuet-1-pH、DH5α/pRSFDuet-1-pH、DH5α/pCOLAduet-1-pH。

將重組菌涂布于對應(yīng)的LB抗性培養(yǎng)基平板上，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，酶切測序驗證無誤后，于盛有液體LB培養(yǎng)基的搖瓶（盛有30 mL培養(yǎng)基的100 mL三角瓶）中，37 ℃、220 r/min發(fā)酵12 h，對發(fā)酵液進(jìn)行蛋白電泳檢測，測定干菌比酶活（試驗設(shè)置3次重復(fù)），對比數(shù)據(jù)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1反式-4-脯氨酸羥化酶基因[HT]

查閱數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/ena/data/view/BAA20094）獲得指孢囊菌RH1的反式-4-脯氨酸羥化酶基因序列，根據(jù)“1.3”節(jié)方法優(yōu)化后得到的序列與原序列對比結(jié)果如圖4所示。通過JCAT軟件優(yōu)化后的序列與模型E. coli（strain K12）對比可知，優(yōu)化前的CAI指數(shù)為0.396 5，優(yōu)化后為0.927 7已經(jīng)非常接近理論最佳值1，而優(yōu)化前的C/G為73.626 3%，優(yōu)化后為59.706 9%，同樣非常接近JCAT軟件計算的E coli.（strain K12）的理論最佳值50.734 0%，共計改變了141個堿基，替換了138個同義密碼子。

2.2翻譯起始區(qū)的設(shè)計及優(yōu)化

由圖5可見，上方為設(shè)計初的翻譯起始區(qū)序列，斜體加粗部分的AG為DNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，下劃線部分為g10-L翻譯增強(qiáng)子序列，其后為RBS序列，其中深色陰影加粗部分為包含了以AAGGA為核心的強(qiáng)SD序列，淺色陰影部分為反式-4-脯氨酸羥化酶編碼基因的前21個密碼子。下方為經(jīng)過RNAstructure軟件優(yōu)化自由能后所得的序列，其中根據(jù)N端規(guī)則將第2個氨基酸由Leu突變?yōu)榱薞al，本次優(yōu)化一共改變了4個核苷酸，替換了3個同義密碼子，最終將起始區(qū)的自由能ΔG由-12.8升高到了-7.6。

2.3啟動子優(yōu)化和表達(dá)盒

由起始區(qū)序列和編碼區(qū)序列經(jīng)構(gòu)建出完整的表達(dá)盒如圖6所示。

2.4重組菌構(gòu)建和宿主菌優(yōu)化

根據(jù)“1.5”節(jié)的方法構(gòu)建重組菌DH5α/pUC-19-pH，提[CM（25][KG*8]取重組質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切（圖7），得到2.8[KG*3]kb和977[KG*3]bp[KG*3][CM）][FL）]

[FK（W5][TPLXC55.tif][FK）]endprint

[FK（W12][TPLXC66.tif][FK）]

[FL（2K2]

[FK（W13][TPLXC77.tif][FK）]

2段條帶，經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序證實完全正確。

運(yùn)用“1.6”節(jié)的方法構(gòu)建重組菌DH5α/pUC19-pH、JM109/pUC19-pH、C43/pUC19-pH、BL21/pUC19-pH、XL-1/pUC19-pH，并于LB液體培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 12 h，蛋白電泳及比酶活結(jié)果如圖8和表2所示。

如圖8所示，31.0 ku附近為反式-4-脯氨酸羥化酶條帶，可知在同等發(fā)酵條件下，以BL21、DH5α為宿主菌所分泌的反式-4-脯氨酸羥化酶蛋白含量較高。由表2分析可知，DH5α/pUC19-pH菌發(fā)酵液中比酶活最高，達(dá)到 0.009 7 U/mg。

2.5質(zhì)粒載體優(yōu)化

根據(jù)“1.7”節(jié)的方法構(gòu)建得到重組菌DH5α/pCDFDuet-1-pH、DH5α/pACYCDuet-1-pH、DH5α/pETDuet-1-pH、DH5α/pRSFDuet-1-pH、DH5α/pCOLAduet-1-pH，并分別抽提得到重組質(zhì)粒pCDFDuet-1-pH、pACYCDuet-1-pH、pETDuet-1-pH、pRSFDuet-1-pH、pCOLAduet-1-pH，經(jīng)雙酶切后分別得到3.7 kb和977 bp、4.0 kb和977 bp、5.4 kb和977 bp、3.8 kb和977 bp、3.7 kb和977 bp一大一小2條條帶，電泳結(jié)果如圖9所示。經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序驗證均完全正確，將重組菌于盛有LB液體培養(yǎng)基的搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，蛋白電泳及比酶活結(jié)果見圖10和表3。

由圖10可知，DH5α/pRSFDuet-1和DH5α/pUC19-pH在31.0 ku附近的蛋白電泳條帶最為清晰明顯，初步判斷pRSFDuet-1和pUC19-pH 2個為最佳質(zhì)粒載體。

[FK（W12][TPLXC110.tif；S+2mm][FK）]

從表3中結(jié)果來看，3次重復(fù)試驗的平均值顯示DH5α/pUC19-pH的比酶活為0.010 8 U/mg，是6個重組大腸桿菌比酶活中的最高值，結(jié)合蛋白電泳結(jié)果，筆者認(rèn)為pUC19-pH即為效果最好的重組質(zhì)粒。

3討論與結(jié)論

本研究通過密碼子優(yōu)化、添加g10-L翻譯增強(qiáng)序列、在RBS 區(qū)內(nèi)設(shè)計SD序列、優(yōu)化翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)來優(yōu)化反式-4-脯氨酸羥化酶的起始效率及延伸效率，成功構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pUC19-pH，并通過對宿主菌及質(zhì)粒載體優(yōu)化最終確定最佳重組大腸桿菌DH5α/pUC19-pH，0.010 8 U/mg的初始比酶活完全具備進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵的潛力。

在后續(xù)的試驗中，可通過以下2點(diǎn)來進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)反式-4-脯氨酸重組大腸桿菌，以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的：（1）在分子層面，首先可以考慮將透明顫菌血紅蛋白基因（VHb）引入重組大腸桿菌中，以提高重組菌對發(fā)酵過程中的溶氧效率，從而解決隨著發(fā)酵時間延長導(dǎo)致溶氧不足的情況。其次，還可以考慮對現(xiàn)有的質(zhì)粒pUC19-pH進(jìn)行改進(jìn)，在質(zhì)粒中加入可表達(dá)的NusA基因序列與反式-4-脯氨酸羥化酶基因共表達(dá)，以提高反式-4-脯氨酸羥化酶的可溶性，酶的可溶性提高后，有助于酶與反應(yīng)體系的催化結(jié)合，從而提高重組大腸桿菌生產(chǎn)反式-4-羥基脯氨酸的效率。（2）設(shè)計單因素發(fā)酵條件優(yōu)化試驗及正交條件優(yōu)化試驗，優(yōu)化影響重組大腸桿菌DH5α/pUC19-pH發(fā)酵的碳氮比、溫度、金屬離子、無機(jī)鹽等重要因素，并運(yùn)用發(fā)酵罐中的間歇補(bǔ)料分批發(fā)酵、勻速流加發(fā)酵等方法探索合理的發(fā)酵方式，以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的工藝要求。

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