汪欲鵬+武志峰+歐陽鴻飛+王智權(quán)+譚雪明+石慶華+潘曉華 吳自明

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.012[HT9.]

摘要：為挖掘控制水稻千粒質(zhì)量的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL），同時(shí)為水稻超高產(chǎn)育種提供重要的育種材料，利用大粒型水稻材料lg1與常規(guī)秈稻品種9311構(gòu)建的F2代遺傳分離群體，采用完備區(qū)間作圖法（ICIM），以LOD值2.5為閥值，對(duì)水稻千粒質(zhì)量QTLs進(jìn)行檢測(cè)、分析。結(jié)果表明，F(xiàn)2代群體中千粒質(zhì)量性狀呈連續(xù)變異的單峰分布，為多基因控制的數(shù)量性狀；共檢測(cè)到千粒質(zhì)量QTLs 5個(gè)，分布于第2、5、9號(hào)染色體上，LOD值介于2.65～11.77之間，表型貢獻(xiàn)率變異范圍為4.62%～52.78%，其中表型貢獻(xiàn)率大于10%的主效QTLs共有3個(gè)；除[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]等位基因來源于9311外，其余4個(gè)QTLs增效等位基因均來自大粒材料lg1。定位的QTLs所在區(qū)間均有相關(guān)QTLs或基因被報(bào)道，是否為等位基因則需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。研究結(jié)果為大粒材料lg1千粒質(zhì)量QTLs的精細(xì)定位及其在水稻超高產(chǎn)育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；大粒型；千粒質(zhì)量；數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）

中圖分類號(hào)： S511.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0046-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-05-20

基金項(xiàng)目：江西省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：20121BBF60009、20132BBF60004）；國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31560350）。

作者簡(jiǎn)介：汪欲鵬（1990—），男，江西贛州人，博士研究生，主要從事作物生理與遺傳育種研究。E-mail：wypkj23@163.com。

通信作者：吳自明，博士，教授，主要從事作物生理與遺傳育種研究。E-mail：wuzmjxau@163.com。

[ZK）]

水稻是世界上重要的糧食作物，其產(chǎn)量的提高對(duì)解決糧食安全問題具有重要的推動(dòng)作用。千粒質(zhì)量性狀與水稻產(chǎn)量息息相關(guān)，同時(shí)也是重要的品質(zhì)性狀，它主要通過控制谷粒的大小及灌漿程度，最終影響水稻的產(chǎn)量[1-3]。隨著耕作方式和水肥管理措施的日益改進(jìn)，通過增加單位面積有效穗數(shù)的方法已很難實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量的大幅度提高，而增加穗質(zhì)量有利于水稻進(jìn)一步增產(chǎn)[4]。改善水稻千粒質(zhì)量是增加穗質(zhì)量的主要途徑之一，有研究表明，千粒質(zhì)量每提高1 g，產(chǎn)量可增加400 kg/hm2[5]。另外，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將控制水稻千粒質(zhì)量數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）或基因?qū)胨酒贩N，進(jìn)而改善水稻千粒質(zhì)量，是提高水稻千粒質(zhì)量的重要方法[6-7]。因此，挖掘控制水稻千粒質(zhì)量的QTLs或基因?qū)λ井a(chǎn)量的增加具有重要意義。

水稻千粒質(zhì)量主要受谷粒大小、灌漿程度的影響，在遺傳上一般表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀，而構(gòu)建定位群體的雙親之間千粒質(zhì)量存在極顯著差異是進(jìn)行千粒質(zhì)量相關(guān)QTL定位的重要前提。張亞東等利用特大粒粳稻材料TD70（千粒質(zhì)量達(dá)80 g）和常規(guī)秈稻品種Kasalath雜交、多代自交構(gòu)建的重組自交系群體，定位得到一系列與谷粒大小相關(guān)的QTLs，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了[WTBX][STBX]qGT2.2、qGW9、qGT9[WTBZ][STBZ]可能的新QTLs[8]。張強(qiáng)等利用極端大粒材料SGL156（千粒質(zhì)量71.90 g）和特小粒材料川7雜交、回交獲得的BC2F2群體，檢測(cè)到28個(gè)與谷粒大小相關(guān)的QTLs，并發(fā)現(xiàn)了一系列可能的新QTLs[9]。孫濱等利用秈稻品種BG1（千粒質(zhì)量達(dá)57.65 g）和粳稻小粒品種XLJ雜交建立的重組自交系群體，共檢測(cè)到34個(gè)粒型、粒質(zhì)量相關(guān)的QTLs，同時(shí)也定位到了一些可能的新的QTLs[10]。此外，已經(jīng)克隆或精細(xì)定位的與千粒質(zhì)量相關(guān)的基因[WTBX][STBX]GS3[WTBZ][STBZ][11]、[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ][12]、[WTBX][STBX]qGL3.1[WTBZ][STBZ][13]、[WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ][14]和[WTBX][STBX]GL2[WTBZ][STBZ][15]等均發(fā)現(xiàn)于大粒型水稻材料。因此，大粒型水稻材料是挖掘新的粒型、粒質(zhì)量QTLs或基因的理想材料。

本研究利用發(fā)現(xiàn)于常規(guī)秈稻品種96-6種植田間的特大粒材料lg1（千粒質(zhì)量47.58 g）與常規(guī)秈稻品種9311雜交、自交構(gòu)建的F2代遺傳分離群體，采用完備區(qū)間作圖法，對(duì)其控制千粒質(zhì)量的QTLs進(jìn)行檢測(cè)和分析，以期為新的千粒質(zhì)量QTL位點(diǎn)的精細(xì)定位和克隆奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為大粒材料lg1在超高產(chǎn)育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大粒型材料lg1是來源于常規(guī)秈稻品種96-6種植田間發(fā)現(xiàn)的特大粒材料，經(jīng)多年種植確認(rèn)其大粒性狀可以穩(wěn)定遺傳。利用秈稻品種9311與大粒材料lg1配制F2代分離遺傳群體，用于千粒質(zhì)量性狀的QTL檢測(cè)。大粒材料lg1、9311及F2代群體均種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園，所有材料采用小區(qū)種植，60株/小區(qū)，株行距約20 cm×20 cm，正常水肥管理。

1.2千粒質(zhì)量性狀的測(cè)定

在成熟期，除去邊株，分別隨機(jī)收取lg1、9311各10株，F(xiàn)2代群體213株單株用于千粒質(zhì)量性狀分析。千粒質(zhì)量利用萬深SC-G自動(dòng)考種儀進(jìn)行測(cè)定，具體為每個(gè)單株取300粒左右飽滿種子稱質(zhì)量，換算為千粒質(zhì)量，即為該單株的千粒質(zhì)量，其中l(wèi)g1、9311測(cè)定10個(gè)單株，取平均值，作為該材料的千粒質(zhì)量。

1.3PCR擴(kuò)增及電泳分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[16]（略有改進(jìn)）提取水稻分蘗期葉片DNA，-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增采用 10 μL 體系：1 μL 10×buffer，0.2 μL dNTP Mix（各 2 mmol/L），2 μL引物（F、R各 2 μmol/L），0.1 μL rTaq酶，1 μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)足至 10 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析，電泳結(jié)果經(jīng)0.1%硝酸銀染色，蒸餾水洗滌，1.5% NaOH溶液顯色后，觀察帶形。endprint

1.4連鎖圖譜的構(gòu)建及千粒質(zhì)量的QTL檢測(cè)

利用大粒材料lg1、9311對(duì)筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的512對(duì)SSR標(biāo)記、Indel標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，將獲得的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)F2代群體中213個(gè)單株進(jìn)行基因型分析，其中帶形與lg1相同的記為2，與9311相同的記為0，雜合型記為1。利用QTL IciMapping 4.0軟件中MAP功能進(jìn)行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建，采用軟件bip功能中的完備區(qū)間加顯性模型（ICIM-ADD），以LOD值2.5為閥值，掃描步長(zhǎng)1.0 cM，在全基因組范圍進(jìn)行千粒質(zhì)量性狀QTL檢測(cè)，QTL的命名遵循McCouch的原則[17]。

[BT1+*8]2結(jié)果與分析

[HTK]2.1大粒型材料lg1與9311千粒質(zhì)量性狀分析[HT]

由圖1、表1可知，大粒型lg1的穗型、粒型均要顯著大于9311，是優(yōu)質(zhì)的大粒型水稻材料。此外，通過測(cè)定可知，lg1千粒質(zhì)量約為47.58 g，比9311大60.26%，兩者之間存在極顯著差異，適合構(gòu)建群體，進(jìn)行千粒質(zhì)量性狀QTL的定位。

2.2F2代群體千粒質(zhì)量性狀分析

由圖2可知，F(xiàn)2代群體中，千粒質(zhì)量性狀呈連續(xù)變異的單峰分布，這表明F2代群體中千粒質(zhì)量性狀是由多主效基因控制的數(shù)量性狀；各單株千粒質(zhì)量變化范圍為29.49～46.74 g，平均值約為37.18 g，偏度、峰度均在-1.51～0.27之間，接近正態(tài)分布，說明獲得的表型數(shù)據(jù)適合用于進(jìn)一步的QTL檢測(cè)分析。

[FK（W10][TPWYP2.tif][FK）]

2.3F2代群體單株基因型鑒定及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用大粒lg1、9311對(duì)512對(duì)SSR、Indel標(biāo)記進(jìn)行篩選，共獲得95對(duì)差異明顯的多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)率為18.55%。利用獲得的95對(duì)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)F2代遺傳分離群體中213個(gè)分離單株進(jìn)行基因型鑒定，與lg1帶形相同的單株基因型記為2，與9311帶形相同的單株基因型記為0，雜合型單株記為1。將各單株的基因型值輸入Map文件中，采用QTL IciMapping 4.0軟件中的MAP功能進(jìn)行連鎖圖譜的構(gòu)建。結(jié)果表明，構(gòu)建的圖譜覆蓋水稻基因組約2 196.67 cM，標(biāo)記間平均距離為23.12 cM，每條染色體上的標(biāo)記數(shù)為7.92個(gè)。

2.4千粒質(zhì)量性狀QTL檢測(cè)結(jié)果分析

由表2、圖3可知，本研究共檢測(cè)到千粒質(zhì)量QTLs 5個(gè)，分布于第2、5、9號(hào)染色體上，LOD值介于2.65～11.77之間，表型貢獻(xiàn)率變異范圍為4.62%～52.78%，其中[WTBX][STBX]qTGW-2-1、qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]貢獻(xiàn)率分布分別達(dá)到了 52.78%、21.78%、17.73%，是3個(gè)控制千粒質(zhì)量性狀的主效QTLs。其中[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]加性效應(yīng)為負(fù)值，增效等位基因來源于9311，檢測(cè)到的其他4個(gè)QTLs加性效應(yīng)均為正值，增效等位基因均來源于大粒材料lg1。

3結(jié)論與討論

千粒質(zhì)量是水稻產(chǎn)量性狀的重要組成部分，定位和克隆與千粒質(zhì)量相關(guān)的基因一直是水稻研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。截至目前，已有[WTBX][STBX]GS3[WTBZ][STBZ][9]、[WTBX][STBX]TGW6[WTBZ][STBZ][18]、[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ][10]、[WTBX][STBX]GW5[WTBZ][STBZ][19]、[WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ][12]、[WTBX][STBX]GS5[WTBZ][STBZ][20]、[WTBX][STBX]GW8[WTBZ][STBZ][21]、[WTBX][STBX]GW6A[WTBZ][STBZ][22]等與千粒質(zhì)量相關(guān)的基因被克隆，利用千粒質(zhì)量相關(guān)的基因或QTLs開發(fā)分子標(biāo)記，應(yīng)用于品種改良中對(duì)水稻增產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用大粒型水稻材

[FL）][FK（W18][TPWYP3.tif][FK）]

[FL（2K2]料lg1與9311構(gòu)建F2代遺傳分離群體，群體中千粒質(zhì)量性狀呈連續(xù)變異的單峰分布，同時(shí)，定位到5個(gè)與千粒質(zhì)量相關(guān)的QTLs，表型貢獻(xiàn)率介于4.62%～52.78%之間，說明千粒質(zhì)量性狀是由多個(gè)微效基因、主效基因控制的數(shù)量性狀。定位到[WTBX][STBX]qTGW-2-1、qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]表型貢獻(xiàn)率均大于17.73%，是3個(gè)主效的千粒質(zhì)量QTLs。對(duì)這些QTLs進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，表現(xiàn)穩(wěn)定的QTLs可用于開發(fā)分子標(biāo)記，應(yīng)用于育種研究中。此外，[WTBX][STBX]qTGW-2-3、qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]加性效應(yīng)為正值，增效等位基因來源于大粒材料lg1，是控制其千粒質(zhì)量的主效QTLs。

與前人的研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究定位到的[WTBX][STBX]qTGW-2-1[WTBZ][STBZ]所在區(qū)間RM7451～RM71已有千粒質(zhì)量相關(guān)基因[WTBX][STBX]GW2[WTBZ][STBZ]被克隆，該基因編碼1個(gè)環(huán)形E3泛素連接酶，將底物錨定至蛋白酶體上進(jìn)行降解，進(jìn)而負(fù)調(diào)控谷粒細(xì)胞分裂[10]。另外，張亞東等也在此區(qū)間內(nèi)定位到了[WTBX][STBX]qGW2-1、qGW2-2、qGT2-1、qGL2-1和qGT2-3[WTBZ][STBZ]等與粒型相關(guān)的QTLs[8]。定位到的[WTBX][STBX]qTGW-2-2[WTBZ][STBZ]所在標(biāo)記區(qū)間RM71～RM13069也是千粒質(zhì)量QTL定位的熱點(diǎn)區(qū)域，張強(qiáng)等在此區(qū)間內(nèi)定位到[WTBX][STBX]qTGW2-1、qRLW2-1和qGT2-1[WTBZ][STBZ]等與千粒質(zhì)量相關(guān)的QTLs[9]；孫濱等也定位到千粒質(zhì)量QTL [WTBX][STBX]qTGW2[WTBZ][STBZ]、粒寬QTL [WTBX][STBX]qGW2-1[WTBZ][STBZ]和粒厚QTL [WTBX][STBX]qGT2-2[WTBZ][STBZ][10]。[WTBX][STBX]qTGW-2-3[WTBZ][STBZ]定位區(qū)間RM13174～RM3763大小為79.86 cM，此區(qū)間內(nèi)有大量與千粒質(zhì)量相關(guān)的QTLs被報(bào)道[6，8，23-24]，同時(shí)已經(jīng)克隆的[WTBX][STBX]GS2也在此區(qū)間內(nèi)，GS2[WTBZ][STBZ]等位基因在miR396靶點(diǎn)發(fā)生1個(gè)稀有的顯性突變，造成該基因表達(dá)顯著上升，促進(jìn)了細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，最終特異地增加了穗長(zhǎng)、籽粒大小[12]。而關(guān)于[WTBX][STBX]qTGW-2-3是否與GS2等位，有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。qTGW-5-1[WTBZ][STBZ]在RM17962～RM169標(biāo)記區(qū)間內(nèi)，已經(jīng)克隆的千粒質(zhì)量相關(guān)基因[WTBX][STBX]GW5在此區(qū)間內(nèi)，GW5[WTBZ][STBZ]編碼1個(gè)核定位蛋白，該基因的功能缺失后泛素不能轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，使得底物不能被特異識(shí)別和降解，從而激活了穎花外殼細(xì)胞的分裂，進(jìn)而穎花外殼的寬度增加，最終谷殼的寬度、粒質(zhì)量及產(chǎn)量都得到了提高[17]，[WTBX][STBX]qTGW-5-1定位的區(qū)間較小，推測(cè)GW5[WTBZ][STBZ]很可能是等位基因。檢測(cè)到[WTBX][STBX]qTGW-9-1[WTBZ][STBZ]所在標(biāo)記區(qū)間為RM3808～RM3249，Xie等在此區(qū)間內(nèi)已經(jīng)精細(xì)定位了粒寬基因[WTBX][STBX]GW9.1[WTBZ][STBZ][25]，孫濱等在該區(qū)間內(nèi)定位到了[WTBX][STBX]qTGW9、qGT9、qGW9[WTBZ][STBZ][10]，[WTBX][STBX]qTGW-9-1所在區(qū)間較小，該位點(diǎn)很可能與GW9.1[WTBZ][STBZ]等位。endprint

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]高繼平，祁澎，林鴻宣. 水稻產(chǎn)量數(shù)量性狀的遺傳調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國科學(xué)（生命科學(xué)），2013，43（12）：1007-1015.

[2]劉建豐，袁隆平. 超高產(chǎn)雜交稻產(chǎn)量性狀研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，28（6）：453-456.

[3]Wang E C，Wang J J，Zhu X D，et al. Control of rice grain-filling and yield by a gene with a potential signature of domestication[J]. Nature Genetics，2008，40（11）：1370-1374.

[4]Wang Y X，Xiong G S，Hu J，et al. Copy number variation at the GL7 locus contributes to grain size diversity in rice[J]. Nature Genetics，2015，47（8）：944-948.

[5]黃庭旭，謝從壽. 水稻超高產(chǎn)育種問題初探[J]. 福建稻麥科技，1998，16（2）：5-7.

[6]朱玉君，樊葉楊，黃得潤，等. 分子標(biāo)記輔助選擇在水稻育種中的應(yīng)用[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（5）：756-761.

[7]謝建平. 水稻分子標(biāo)記輔助育種研究進(jìn)展[J]. 種子，2006，25（11）：43-45.

[8]張亞東，張穎慧，董少玲，等. 特大粒水稻材料粒型性狀的QTL檢測(cè)[J]. 中國水稻科學(xué)，2013，27（2）：122-128.

[9]張強(qiáng)，姚國新，胡廣隆，等. 利用極端材料定位水稻粒形性狀數(shù)量基因位點(diǎn)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（5）：784-792.[ZK）]

[10][ZK（#]孫濱，占小登，林澤川，等. 水稻粒形和粒重性狀的相關(guān)性分析及QTL定位[J]. 分子植物育種，2015，13（12）：2663-2672.

[11]Fan C，Xing Y，Mao H，et al. GS3，a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice，encodes a putative transmembrane protein[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，112（6）：1164-1171.

[12]Song X J，Huang W，Shi M，et al. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J]. Nature Genetics，2007，39（5）：623-630.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）][LM]

[KH*4D]

[HT8.]

[13][ZK（#]Qi P，Lin Y S，Song X J，et al. The novel quantitative trait locus [WTBX][STBX]GL3.1[WTBZ][STBZ] controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1；3[J]. Cell Research，2012，22（12）：1666-1680.

[14]Hu J，Wang Y，F(xiàn)ang Y，et al. A rare allele of [WTBX][STBX]GS2[WTBZ][STBZ] enhances grain size and grain yield in rice[J]. Molecular Plant，2015，8（10）：1455-1465.

[15]Che R，Tong H，Shi B，et al. Erratum：control of grain size and rice yield by GL2-mediated brassinosteroid responses[J]. Nature Plants，2015，2（1）：15195.

[16]Murray M G，Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4325.

[17]McCouch S R. Gene nomenclature system for rice[J]. Rice，2008，1（1）：72-84.

[18][JP3]Ishimaru K，Hirotsu N，Madoka Y，et al. Loss of function of the IAA-[JP]glucose hydrolase gene [WTBX][STBX]TGW6[WTBZ][STBZ] enhances rice grain weight and increases yield[J]. Nature Genetics，2013，45（6）：707-711.

[19]Weng J，Gu S，Wan X，et al. Isolation and initial characterization of [WTBX][STBX]GW5[WTBZ][STBZ]，a major QTL associated with rice grain width and weight[J]. Cell Research，2008，18（12）：1199-1209.endprint

[20]Li Y，F(xiàn)an C，Xing Y，et al. Natural variation in GS5 plays an important role in regulating grain size and yield in rice[J]. Nature Genetics，2011，43（12）：1266-1269.

[21][JP3]Wang S，Wu K，Yuan Q，et al. Control of grain size，shape and quality [JP]by [WTBX][STBX]OsSPL16[WTBZ][STBZ] in rice[J]. Nature Genetics，2012，44（8）：950-954.[JP]

[22]Song X J，Kuroha T，Ayano M，et al. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight，yield，and plant biomass in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（1）：76-81.

[23]蔣鈺東，羅俊濤，況浩池，等. 利用兩個(gè)秈稻雜交F2定位水稻粒型、粒重QTL[J]. 分子植物育種，2015，13（8）：1689-1694.

[24]李孝瓊，韋宇，高國慶，等. 水稻遺傳圖譜構(gòu)建及粒形相關(guān)性狀的QTL定位[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（7）：1154-1159.

[25]Xie X，Jin F，Song M H，et al. Fine mapping of a yield-enhancing QTL cluster associated with transgressive variation in an Oryza sativa×O. rufipogon cross[J]. Theoretical and Applied Genetics，2008，116（5）：613-622.endprint