禹海鑫+安榆林+郭驍駒+孫民琴+徐寧

摘要：白條天牛屬的天牛是一類嚴(yán)重危害多種林木的蛀干害蟲。為了豐富白條天牛屬線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因數(shù)據(jù)庫，探索該屬各種類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以利于用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因作DNA條形碼快速準(zhǔn)確地鑒定白條天牛種類。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增3種白條天牛標(biāo)本的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列，并與GenBank記錄的4種白條天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列進(jìn)行比對，以分析其序列組成變異及堿基替換規(guī)律，最后利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，白條天牛的親緣關(guān)系與地理分布有關(guān)，同一國家的白條天牛之間的親緣關(guān)系較近，不同國家的白條天牛之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：白條天牛；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因；基因條形碼；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

中圖分類號： S433.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0090-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：江蘇省出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計劃項(xiàng)目（編號：2014KJ48）。

作者簡介：禹海鑫（1984—），男，河南泌陽人，博士，農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫、昆蟲分類和昆蟲分子化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。Tel：（0513）68588180；E-mail：haixin.007@163.com。

[ZK）]

溝脛天牛亞科（Laniinae）隸屬于鞘翅目（Cleoptera）天牛科（Cerambycidae），是天?？品N類數(shù)目最多的一個亞科，全世界已知種類大約20 000種。其中白條天牛屬（Batocera）昆蟲是該亞科內(nèi)十分重要的一類林木害蟲，它的幼蟲鉆蛀取食樹木的樹干及枝條的木質(zhì)部、韌皮部，可危害柳樹、蘋果樹、櫟樹、楊樹等多個闊葉樹種，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。全世界白條天牛種類約有60種，廣泛分布在非洲、澳大利亞、亞洲和東歐地區(qū)。我國約有12種，包括銹斑白條天牛（B. numitor Newman）、麻櫟白條天牛（B. quercinea Wang et Zhang）等[2-3]。除上述12種外，余下約50種在我國是沒有分布的，被2007年發(fā)布的《進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》列為我國檢疫性昆蟲[2]。

近年來，隨著我國外向型經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展，原木和木質(zhì)包裝進(jìn)出口數(shù)量劇增，我國多個口岸在進(jìn)境木材檢疫查驗(yàn)中截獲了白條天牛。例如，2009年乍浦口岸檢疫人員從馬來西亞進(jìn)境原木中首次截獲托氏白條天牛（B. thomsoni）[4]。2012年張家港口岸從巴布亞新幾內(nèi)亞原木中截獲白條天牛B. laena[5]。另據(jù)相關(guān)媒體報道，2013年張家港口岸從非洲原木中截獲到白條天牛B. wyllei[6]。2014年，吳江口岸在進(jìn)境原木中截獲了婆羅白條天牛（B. tigris）[7]。

目前，昆蟲種類鑒定以形態(tài)學(xué)鑒定為主，但可用于形態(tài)比較的特征數(shù)量有限且不穩(wěn)定，同時國門口岸截獲的昆蟲往往是以卵、幼蟲、蛹或肢體殘缺蟲態(tài)出現(xiàn)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法顯然不適用[8]；因此，需要探索新方法來解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定中遇到的困境。隨著分子試驗(yàn)技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用DNA序列研究遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育及種類鑒定已經(jīng)成為昆蟲學(xué)研究的熱點(diǎn)。其中，基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mtDNA COⅠ）基因序列的DNA條形碼技術(shù)是當(dāng)前相對成熟的分子鑒定技術(shù)[9]。花婧等通過此技術(shù)對大小蠹屬17個種進(jìn)行了分子鑒定[10]。Stauffer等利用該技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對歐洲7種齒小蠹的快速鑒定[11]。

本研究對已獲得的6種白條天牛的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段進(jìn)行測序和對比，分析這些CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列（即DNA條形碼）的特征及遺傳系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以獲得能準(zhǔn)確鑒定白條天牛種類的分子方法，為研究其他天牛種類的分子鑒定方法提供有益參考[12]。

1材料與方法

1.1昆蟲標(biāo)本

本試驗(yàn)所用的標(biāo)本由南通出入境檢驗(yàn)檢疫局有害生物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供，包括銹斑白條天牛（B. davidis）、橙斑白條天牛（B. numitor）、印尼白條天牛（B. celebiana）3種白條天牛，所有天牛標(biāo)本均經(jīng)國內(nèi)天牛專家安榆林研究員鑒定。標(biāo)本來源與采集時間如表1所示。另外，從GenBank網(wǎng)站獲得4種白條天牛共7條CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列（表2）用于比對。其中，印尼白條天牛（B. celebiana）是在我國沒有分布的國外種類，余下3種天牛在我國均有分布。

1.2提取基因組DNA

采用從北京金麥格生物技術(shù)有限公司購買的GenMagBio動物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒提取各樣品的基因組DNA。提取方法：用雙蒸水沖洗100%乙醇浸泡的天牛肌肉組織（應(yīng)少于30 mg），轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，置于MM400球磨儀研磨30 s（30次/s）后，12 000 r/min離心 10 min。離心后加180 mL裂解緩沖液及20 mL Proteinase K，于55 ℃水中溫浴10 min。再加200 mL無水乙醇、200 mL緩沖液、20 mL磁珠，用磁珠來吸附基因組DNA，然后加 500 mL Wash Buffer去雜。最后加20 μL Elution Buffer，靜置5 min后洗脫磁珠即得樣品的基因組DNA溶液[10，13]。

1.3CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]片段擴(kuò)增和測序

在ProFlexTM PCR儀（購自ABI公司）上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)采用25 μL體系，其中2 μL MgCl2（25 mmol/L），2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）（購自TaKaRa公司），上、下游引物（10 μmol/L）（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）各0.5 μL，加滅菌水至25 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃保持1 min，設(shè)置35個循環(huán)；最后在 72 ℃ 下延伸10 min。反應(yīng)完畢將PCR產(chǎn)物送到南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序[13-14]。本試驗(yàn)PCR反應(yīng)采用巢式PCR，第1輪反應(yīng)引物為F1、R1，第2輪PCR引物為F2、R2[13]，各引物序列如表3所示。本試驗(yàn)利用巢式PCR既降低了擴(kuò)出多個非目標(biāo)基因條帶的可能性，也提高了PCR檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度endprint

1.4序列分析和建樹

將測得的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列導(dǎo)入SeqMan分析軟件中進(jìn)行拼接及校正[16]。利用NCBI中的Blast工具搜索相似性序列，以確認(rèn)序列的方向和可信度。再將所測序列與從GenBank上獲得的白條天牛序列共同載入Clustal X 1.83軟件中進(jìn)行比對[17]。將序列比對結(jié)果導(dǎo)入MEGA 5.05軟件中[18]算出白條天牛種類間的轉(zhuǎn)換/顛換（R）、變異位點(diǎn)（V）、保守位點(diǎn)（C）等[12，14]。最后使用MEGA 5.05軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1 000次。

2結(jié)果與分析

2.1DNA凝膠電泳結(jié)果

本試驗(yàn)對3種白條天牛樣品基因組DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）表明，3個樣品在525 bp處均有清晰明亮、特異性好的條帶，且沒有非特異性條帶出現(xiàn)，可滿足后續(xù)基因測序的需要。

2.2白條天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列解析

2.2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列特征

將各序列導(dǎo)入MEGA 5.05軟件，均切成同等長度（434 bp）的片段[15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)分別為314、120、117、195個。另外，統(tǒng)計所有位點(diǎn)堿基的平均含量，結(jié)果顯示，A的平均含量為29.5%，T的平均含量為33.8%，G的平均含量為19.0%，C的平均含量為17.7%[12-14]。其中，A和T的含量相當(dāng)，且A+T的含量為63.3%，明顯高于G+C的含量（36.7%），顯示出了顯著的A+T堿基偏嗜。這也與昆蟲線粒體基因各堿基組成的基本規(guī)律相吻合[15，19]。

2.2.2堿基替換規(guī)律分析

用MEGA 5.05軟件分析序列各位點(diǎn)堿基替換規(guī)律[20]，結(jié)果（表4）表明，位點(diǎn)轉(zhuǎn)換主要出現(xiàn)在C與T之間，顛換主要出現(xiàn)在T與A之間，R的平均值為0.78。對密碼子各位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，在第2位點(diǎn)上易發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換，且轉(zhuǎn)換值與顛換值相近（R=0.77）。此外，第1、第3位點(diǎn)的R值分別為0.67、0.91。此結(jié)果表明，序列各位點(diǎn)R值均小于2，說明該序列轉(zhuǎn)換與顛換未達(dá)飽和，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹要充分考慮轉(zhuǎn)換和顛換的發(fā)生比率。

2.2.4建立系統(tǒng)發(fā)育樹

利用MEGA 5.05軟件建立白條天牛屬系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可知，B. horsfieldi 1與B. horsfieldi 2聚為一小支，且與B. horsfieldi 3聚為一支；B. lineolata 1與B. lineolata 2聚為一小支。說明同種類白條天牛個體間均可[FL）]

[FK（W51][TPYHX2.tif][FK）]

[FL（2K2]以分別聚為一支，因此，同種類白條天牛可以和其他種類白條天牛較好地區(qū)分開來，這也與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。從整體上看，我國已有分布的5種（8頭）白條天牛B. rubus、B. horsfieldi、B. davidis、 B.lineolata、B.numitor聚為一大支，而我國尚未有分布的1種（2頭）白條天牛B.celebiana聚為一支，2支親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，互為姊妹群。結(jié)果表明，白條天牛的親緣關(guān)系與地理分布有關(guān)，同一國家白條天牛種類之間的親緣關(guān)系較近，但與其他國家白條天牛種類之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3結(jié)論與討論

線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因含有較多既相對保守又有足夠變異的遺傳信息位點(diǎn)，常被當(dāng)作DNA條形碼用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中[21]。黃麗莉等利用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因?qū)崿F(xiàn)了對6個不同地理種群茶黃薊馬與其他4種常見薊馬的快速鑒定[22]。李京通過對天?？?6種天牛線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列特征及系統(tǒng)發(fā)育的研究，初步弄清楚了各類群間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[23]。鄭絲竹也對天?？?亞科160種天牛進(jìn)行了CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列特征數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，并由此建立了160種天?？焖俜肿予b定的技術(shù)體系[24]。

近年來，隨著我國外向型經(jīng)濟(jì)水平的持續(xù)提升，各口岸進(jìn)出口貨物量劇增。我國口岸從進(jìn)口貨物中截獲的天?？评ハx種類、數(shù)量增多，但這些天牛多以卵、幼蟲及蛹蟲態(tài)和肢體殘缺的成蟲等形態(tài)出現(xiàn)，用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法鑒定存在較大困難。用線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段作DNA條形碼用于昆蟲種類的分子鑒定，極大程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷[25]；但是，目前該方法在白條天牛種類鑒定中的應(yīng)用還未見報道。

本研究通過對3種白條天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列與GenBank中已公開的白條天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列既可有效區(qū)分白條天牛種類，又能提供豐富的物種親緣關(guān)系信息。建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中包含的信息與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符，同時也證實(shí)了白條天牛種類間的親緣關(guān)系與地理分布有關(guān)。本試驗(yàn)的結(jié)果不僅對白條天牛CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了補(bǔ)充和完善，也為下一步將CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因分析方法應(yīng)用于口岸多種檢疫性天牛的種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究提供基礎(chǔ)。值得關(guān)注的是，由于不同的基因含有不同的遺傳進(jìn)化信息，也具有不同的遺傳進(jìn)化速率，因此，在后續(xù)的檢疫性天牛系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中，為了得到更精確的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，還需要在結(jié)合多個基因分析、多種成蟲、幼蟲形態(tài)特征及多種建樹方法等方面努力。

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