劉榮+申剛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.027摘要：采用梯度稀釋平板涂布法從土壤中分離并純化細(xì)菌，通過平板對(duì)峙法、濾紙片法篩選出拮抗薏苡黑粉菌的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)觀察、16S rRNA基因序列分析鑒定菌株，并優(yōu)化其發(fā)酵條件。結(jié)果表明，共分離得到拮抗菌株16個(gè)，其中拮抗菌菌株X-2對(duì)薏苡黑粉菌的抑制率相對(duì)最高，為66.7%，能夠明顯抑制病原菌的生長；經(jīng)鑒定，菌株X-2為枯[JP2]草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最適發(fā)酵條件為溫度34 ℃、pH值6.0、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量4%、裝液量200 mL/L。[JP]

關(guān)鍵詞：薏苡；黑穗??；拮抗菌；鑒定；發(fā)酵條件；菌株X-2

中圖分類號(hào)： S435.19文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0097-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-13

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳、貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合基金（編號(hào)：黔科合J字LKN[2013]13）；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專項(xiàng)資金（編號(hào)：黔農(nóng)科院院專項(xiàng)[2014]010）；貴州省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：黔科合SY字[2015]3023-4）。

作者簡介：劉榮（1986—），女，貴州甕安人，碩士，助理研究員，主要從事基因工程與分子生物學(xué)研究。E-mail：gzlr0129@163.com。

通信作者：申剛，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事特色資源植物研究。E-mail：shengang404@163.com。

[ZK）]

薏苡黑穗病由黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，該病原菌屬擔(dān)子菌亞門黑粉菌目黑粉菌科，易感染、分布廣，在大多數(shù)國家均有報(bào)道[1-2]。隨感病薏苡雜交種的推廣、連作薏苡的增加，薏苡黑穗病不斷蔓延、加重，導(dǎo)致薏苡減產(chǎn)嚴(yán)重。1957、1958年田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，薏苡黑穗病危害十分嚴(yán)重，大田平均病株率達(dá)80%～100%，病癭率達(dá)50%以上[3]。

目前，防治薏苡黑穗病的主要措施有藥劑防控、輪作和篩選抗病品種，而通過篩選拮抗菌獲得生物菌劑進(jìn)行生物防治的研究報(bào)道相對(duì)較少。篩選薏苡黑穗病菌的拮抗菌株一方面可為黑穗病的生物防治提供更多選擇，另一方面能降低環(huán)境污染，為其他作物黑穗病的防控提供借鑒。筆者采用梯度稀釋平板涂布法從土壤中分離并純化細(xì)菌，通過平板對(duì)峙法、濾紙片法獲得拮抗薏苡黑粉菌的菌株，對(duì)薏苡黑穗病有穩(wěn)定抑菌效果，這為薏苡黑穗病的生物防控提供了技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

薏苡黑粉菌，由貴州省亞熱帶作物研究所生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。供試土樣于2014年7—10月從貴州省興義市各個(gè)縣（市）采集，選取薏苡黑穗病發(fā)病較重的地塊，采集發(fā)病植株及健康植株根圍的土壤，合計(jì)99份，用封口袋密封，貼上標(biāo)簽帶回實(shí)驗(yàn)室。2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自Tiangen公司；氨芐青霉素，購自Sangon Biotech公司；Ezup柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細(xì)菌），購自上海生工公司；引物合成和測(cè)序由英濰捷基公司完成。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：稱取馬鈴薯200 g，洗凈，去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h；紗布過濾，加20 g葡萄糖、14 g瓊脂，充分溶解，并補(bǔ)足水；分裝，121 ℃滅菌 20 min。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA，1 000 mL）：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白陳5 g，葡萄糖10 g，pH值7.0；121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離、純化及保存細(xì)菌分離采用稀釋涂布法[4]，具體步驟為：稱取風(fēng)干土樣10 g，置于盛有90 mL無菌水、帶有玻璃珠的三角瓶中，搖床上160 r/min振蕩培養(yǎng) 30 min；靜置5 min，吸取1 mL懸浮液置于裝有9 mL無菌水的試管中，混勻，逐級(jí)梯度稀釋；取10-4、10-5、10-6 3個(gè)梯度的懸浮液0.1 mL于冷卻的NA培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)梯度重復(fù)3次，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；挑取菌落形態(tài)不一樣的單菌落在NA平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)純化4次；挑取單菌落于NA斜面上，37 ℃培養(yǎng)24 h，4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2拮抗菌的篩選

1.2.2.1初篩將5 mm薏苡黑粉菌菌餅接入PDA平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d；采用平板對(duì)峙法在距菌餅中央等距離4點(diǎn)處接入細(xì)菌分離菌株，以未接細(xì)菌處理為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)；待對(duì)照病原菌長滿平板時(shí)，觀察抑菌效果，記錄抑菌圈大小。每處理重復(fù)3次。

1.2.2.2復(fù)篩將5 mm薏苡黑粉菌菌餅接入PDA平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d；挑取細(xì)菌分離物接入NA培養(yǎng)液中，160 r/min 28 ℃搖床培養(yǎng)36 h，即獲得細(xì)菌發(fā)酵液；距菌餅中央等距離對(duì)峙3點(diǎn)處放置直徑為6 mm的無菌濾紙片，吸取10 μL細(xì)菌發(fā)酵液于濾紙片上，28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以未接細(xì)菌發(fā)酵液處理為對(duì)照；待對(duì)照病原菌長滿平板時(shí)，觀察抑菌效果，記錄抑菌圈大小，計(jì)算抑制率。每處理重復(fù)3次。

1.2.3拮抗菌的鑒定參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《芽孢桿菌屬》[5-7]，觀察平板上單菌落的顏色、氣味、透明度、光澤及邊緣形狀等，革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色，顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。對(duì)菌株進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)（M.R）、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)及淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、明膠水解試驗(yàn)等生化試驗(yàn)。對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA 序列分析：按照上海生工Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒使用說明提取細(xì)菌基因組DNA；以基因組DNA為模板，采用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：2× Taq PCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)齊至 50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得的序列利用DNAStar軟件和Blastn程序進(jìn)行序列比對(duì)分析。endprint

1.2.4菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化采用單因子變量法對(duì)菌株X-2生長的最適溫度、最適裝液量、最適pH值等生長條件進(jìn)行優(yōu)化，以不接菌培養(yǎng)液為對(duì)照，測(cè)定波長600 nm處的吸光度，以此反映培養(yǎng)菌株X-2的生物量。每試驗(yàn)處理重復(fù)3次。種子液的制備：接種菌株X-2接入裝有5 mL NA培養(yǎng)基的試管中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，即獲得種子液。

1.2.4.1培養(yǎng)時(shí)間取1 mL種子液（1×108 CFU/mL），接種于30 mL NA培養(yǎng)液中，30 ℃ 160 r/min培養(yǎng)，0～18 h之間每隔2 h取樣1次。

1.2.4.2溫度取1 mL種子液（1×108 CFU/mL），接種于30 mL NA培養(yǎng)液中，分別置于20、25、30、34、37、40 ℃溫度條件、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.4.3初始pH值取1 mL種子液（1×108 CFU/mL），分別接種于pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的NA培養(yǎng)液中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.4.4搖床轉(zhuǎn)速等量接種1.5 mL的種子液（1×108 CFU/mL）于30 mL NA培養(yǎng)液中，分別進(jìn)行80、100、120、160、180、200 r/min 30 ℃搖瓶振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.4.5接種量取振蕩培養(yǎng)12 h的種子液（1×108 CFU/mL），分別按體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接種量接入30 mL NA培養(yǎng)液中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.4.6裝液量100 mL三角瓶中分別裝入10、20、30、40、50 mL NA培養(yǎng)液，滅菌，按3%體積分?jǐn)?shù)接入菌齡為12 h的種子液（1×108 CFU/mL），30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的篩選

結(jié)果表明，通過稀釋涂布法從土壤中分離并純化細(xì)菌菌株200個(gè)；采用平板對(duì)峙法初篩到16個(gè)對(duì)黑粉菌有不同拮抗作用的菌株，依次為X-2、103、22、37、45、46、47、42、4-13、4-6、3-1、3-2、3-3、2-6、2-7、4-5；16個(gè)細(xì)菌菌株經(jīng)發(fā)酵液濾紙片法復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，16個(gè)菌株對(duì)黑粉菌均有抑制作用，其中以菌株X-2的抑制率相對(duì)最高，為66.7%，具有明顯的抑菌帶，病原菌菌落邊緣與抑菌帶接觸部位的菌絲發(fā)生溶解（圖1、圖2），這說明菌株X-2對(duì)薏苡黑穗病的拮抗作用較強(qiáng)。[FL）]

2.2拮抗菌的鑒定

將菌株X-2接種到NA培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，結(jié)果表明，菌株X-2的菌落呈白色，圓形，邊緣不規(guī)則，表面粗[JP3]糙，不透明，不產(chǎn)色素；菌體形態(tài)為桿狀，大?。?.5～0.6） μm×[JP]（1.6～3.0） μm；產(chǎn)生芽孢，位于菌體中央或偏稍，芽孢形成后菌體不膨大；革蘭氏染色為陽性。初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。經(jīng)生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株X-2的淀粉、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、明膠、乳糖水解試驗(yàn)及檸檬酸鹽試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)（M.R）、吲哚試驗(yàn)為陽性，葡萄糖水解、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性。以菌株X-2基因組DNA為模板，經(jīng)引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果表明，菌株X-2的基因片段長度約為948 bp（圖3）；經(jīng)Blast序列分析，親緣關(guān)系相近的前20個(gè)序列都為芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株，菌株X-2與其有99%以上的同源性，其中與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達(dá)到99%。綜合形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rRNA基因序列，將菌株X-2鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3菌株X-2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1培養(yǎng)時(shí)間由圖4可見，菌株X-2培養(yǎng)0～4 h生長緩慢，為遲緩期；培養(yǎng)4～12 h時(shí)生長較為迅速，為對(duì)數(shù)生長期；培養(yǎng)12～16 h生長趨于平緩，為穩(wěn)定期；16 h后逐漸減少，菌株X-2進(jìn)入衰亡期；菌株X-2培養(yǎng)14 h的生長量相對(duì)最大。因此，菌株X-2以培養(yǎng)6～14 h的培養(yǎng)液為最適菌株發(fā)酵種子。

2.3.2溫度由圖5可見，20～40 ℃范圍內(nèi)，菌株X-2均能生長；隨溫度升高，菌株X-2的生物量呈先增加后減少趨勢(shì)；30～37 ℃時(shí)，菌株X-2的生物量相對(duì)較大，其中34 ℃時(shí)生物量達(dá)到最大值。因此，菌株X-2的最適發(fā)酵溫度為 34 ℃。

2.3.3初始pH值由圖6可見，培養(yǎng)液不同初始pH值條件下，菌株X-2的生物量影響不大；pH值為5.0～9.0時(shí)菌株X-2均能較好生長；pH值為 6.0時(shí)，菌株X-2生長較好且產(chǎn)抑菌物質(zhì)相對(duì)最大，說明該菌的最適生長pH值為6.0。

2.3.4搖床轉(zhuǎn)速由圖7可見，隨搖床轉(zhuǎn)速的增加，菌株 X-2的生物量呈先增加后減少的趨勢(shì)；轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌株X-2的生物量相對(duì)最大。因此，菌株X-2的最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.3.5接種量由圖8可見，在一定范圍內(nèi)，菌株X-2的接種量對(duì)發(fā)酵液的生物量影響不大；接種量為4%時(shí)，菌株 X-2的生物量相對(duì)最大，接種量大于4%時(shí)，菌株X-2的生物量趨于穩(wěn)定。因此，菌株X-2的最佳接種量為4%。

2.3.6裝液量由圖9可見，160 r/min轉(zhuǎn)速下，隨著三角瓶中裝液量的增加，菌株X-2的生物量呈先增加后逐漸減少的趨勢(shì)；裝液量為20 mL時(shí)，菌株X-2的生物量相對(duì)最大。因此，菌株X-2的最適裝液量為20 mL。

3結(jié)論與討論

目前，防治薏苡黑穗病的常用藥劑主要有三唑酮、甲基硫

菌靈、多菌靈等。研究多菌靈重復(fù)施用后在薏苡仁、土壤中的殘留動(dòng)態(tài)及對(duì)土壤微生物群落的多樣性影響發(fā)現(xiàn)，距最后1次施藥間隔期21、30 d采樣，薏苡仁中多菌靈的殘留量為008～0.27 mg/kg，土壤中多菌靈的殘留量為ND～1.14 mg/kg，多菌靈對(duì)土壤微生物的抑制作用隨處理濃度增加而增強(qiáng)[8-9]。20世紀(jì)50年代以來，劉穎等從枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中分離出抗真菌肽，并不斷發(fā)現(xiàn)抗生素、細(xì)菌素、細(xì)胞壁降解酶類等抗菌物質(zhì)[10-12]。從現(xiàn)有植物病害的生防物質(zhì)看，用于生物防治的微生物有細(xì)菌、真菌、病毒等，其中細(xì)菌種類相對(duì)較多[13-14]，主要有枯草芽孢桿菌、假單胞桿菌、土壤放射桿菌，枯草芽孢桿菌因其具有較強(qiáng)的抗逆性、容易保存等優(yōu)點(diǎn)而具有巨大的生防潛力和應(yīng)用前景[15-18]?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)能溶解病原菌菌絲的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，造成其原生質(zhì)外溢、菌絲斷裂或畸形，同時(shí)可抑制孢子的萌發(fā)[16]；或在植物的根部形成一層生物膜，保護(hù)植物根部免受病原菌的侵染[19]；或同時(shí)分泌多種結(jié)構(gòu)相似的抗菌物質(zhì)，如菌株B2胞外存在脂肽類抗生素表面活性素、多烯類及一種分子量為564結(jié)構(gòu)未知的新物質(zhì)這3種抑菌物質(zhì)，表現(xiàn)出協(xié)同的抑菌效果[20-21]。endprint

本研究從土壤中分離得到1個(gè)對(duì)薏苡黑穗病病原菌有拮抗作用的細(xì)菌菌株X-2，結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，鑒定菌株X-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最佳發(fā)酵條件為溫度34 ℃、pH值6.0、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量4%、100 mL三角瓶裝液量20 mL。這與鞠瑞成等的研究結(jié)論[22-23]有一定差別，可能與分離的菌株不同有關(guān)。另外，雖然從土壤中分離得到了拮抗菌株，但其對(duì)薏苡黑穗病的拮抗機(jī)制、是否產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等須進(jìn)行深入研究。

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