郭海燕+金銀+李擁軍+張昊+程國虎

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.035[HT9.]

摘要：利用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）技術(shù)及基因測序技術(shù)對湖羊進(jìn)行了ESR基因的多態(tài)性檢測及其與湖羊產(chǎn)羔數(shù)的統(tǒng)計分析。測序結(jié)果表明，等位基因G與C相比發(fā)生了1處堿基突變（G363C）。ESR基因在湖羊中存在多態(tài)性（CC、CG和GG）；湖羊中C等位基因的頻率為0.743，G等位基因的頻率為0.257。CC、CG、GG基因型頻率分別為0.564、0.357、0.079。湖羊CG、GG、CC基因型的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.98、1.80、1.96只。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，ESR基因的多態(tài)性對湖羊產(chǎn)羔數(shù)的影響差異不顯著（P≥0.05）。

關(guān)鍵詞：湖羊；ESR基因；產(chǎn)羔數(shù)

中圖分類號： S826.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0126-03[HS）][HT9.SS]

[HJ1.4mm]

收稿日期：2017-01-03

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（15）1007]。

作者簡介：郭海燕（1992—），女，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向為遺傳育種與繁殖。E-mail：1937750042@qq.com。

通信作者：李擁軍，博士，教授，研究方向為養(yǎng)羊生產(chǎn)與羊的繁育。Tel：（0514）87996481；E-mail：liyj@yzu.edu.cn。[HJ]

[ZK）]

湖羊是我國著名的地方多胎品種羊，也是我國一級保護(hù)地方畜禽品種，主要分布在江、浙一帶。湖羊1年2胎，每胎多羔，其產(chǎn)羔率能達(dá)到200%～250%[1]。綿羊的繁殖力是影響其經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)之一，而湖羊又是我國著名的多胎品種，因此研究其多胎的分子機(jī)制對于湖羊多胎資源的開發(fā)利用、新品種的培育以及生產(chǎn)實踐都有著重要意義。

湖羊高產(chǎn)的繁殖性能是得到世界公認(rèn)的，因此探究并確定影響湖羊多胎的主效基因一直是國內(nèi)外的研究熱點。綿羊的多胎性狀是由多種基因控制的，且不同品種間控制多胎的主效基因也是不同的。有研究發(fā)現(xiàn)，品種之間繁殖性能的差異主要取決于產(chǎn)仔母羊的基因，與后代個體基因無太大關(guān)系，且推斷湖羊具有多胎的主基因，并呈顯性遺傳[2-3]。很多學(xué)者已證實了[WTBX][STBX]BMPR-IB[WTBZ][STBZ]可能是湖羊多胎性的主效基因，而[WTBX][STBX]BMP15、GDF9[WTBZ][STBZ]等基因可能也參與并影響了湖羊的多胎機(jī)制[4-6]。有研究證明湖羊存在FecB基因，且湖羊全部為FecB基因純合攜帶者[7-8]。

雌激素受體（estrogen receptor，簡稱ESR）是核受體超家族的一員，是一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子[9]。ESR能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)，參與雌性動物性腺基因的表達(dá)與調(diào)控。ESR結(jié)合配體之后與雌激素應(yīng)答元件相互作用，可以改變受雌激素調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響胚胎發(fā)育和系統(tǒng)分化[10]。

許多研究都表明，ESR基因在動物繁殖過程中發(fā)揮著重要作用，而且已經(jīng)確定ESR基因是影響豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因[11-17]。研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠的ESR基因敲除后，小鼠不能排卵，這也證明了ESR基因與繁殖性能的重要聯(lián)系[18]。張小雪等對綿羊的ESR基因進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)綿羊的ESR基因主要位于細(xì)胞核中，并且參與機(jī)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程[19]。有研究認(rèn)為ESR可能是控制湖羊和小尾寒羊多胎性能的主效基因或與之存在緊密的連鎖[9，20]。賈立華等對小尾寒羊的ESR基因外顯子4序列進(jìn)行克隆與序列分析，發(fā)現(xiàn)此段序列有很強(qiáng)的保守性[21-22]。馮濤等也得出了相同結(jié)論，發(fā)現(xiàn)哺乳動物ESR基因外顯子1、4序列的保守性較強(qiáng)，因此此段區(qū)域可能不是影響山羊高繁殖力的功能結(jié)構(gòu)域[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因第5外顯子Pvu Ⅱ多態(tài)性與動物的繁殖性能密切相關(guān)，但該位點在不同群體中的效應(yīng)不一致[24-27]。此外，ESR基因?qū)ε咛グl(fā)育及黃體期的影響及作用也一直是國內(nèi)外研究熱點[28-30]。本試驗通過研究湖羊ESR基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，旨在為篩選湖羊多胎性候選基因提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物及血樣采集

選取具有第1胎和第2胎生產(chǎn)記錄的湖羊，共342只。采集湖羊頸靜脈血液約3 mL，并記錄耳標(biāo)號，羊全部來自江蘇省太倉金倉湖羊場。采血用一次性采血盛血器，并且提前在采血管中加入ACD抗凝劑（主要含枸椽酸、枸椽酸三鈉、葡萄糖）。血樣用冰盒帶回實驗室后于4 ℃保存，以供提取DNA。

1.2DNA的提取及檢測

DNA提取方法參照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒說明書，提取后于-20 ℃保存。

1.3PCR的擴(kuò)增

ESR的引物參照畢曉丹的方法[9]，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：5′-TGCACCAGATCCAAGCCAACGA-3′；

下游引物：5′-CGGGTACCTGTAGAAGGCGGGAG-3′。

PCR反應(yīng)體系25 μL，其中DNA 1 μg，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]12.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，57 ℃復(fù)性90 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢測。

[HTK]1.4單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測多態(tài)性[HT]endprint

取5 μL PCR產(chǎn)物，并與5 μL上樣緩沖液（90%去離子甲酰胺9 mL，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，1×TBE 1 mL）混合后置于PCR管內(nèi)，98 ℃變性10 min，迅速放入 -20 ℃ 冰箱10 min，使之保持變性狀態(tài)。然后用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（120 V，3 h），電泳結(jié)束銀染顯色，拍照分析。

1.5公司測序

將提取的DNA全部送到無錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序及基因型的鑒定，并整理數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.6統(tǒng)計分析

收集整理湖羊的生產(chǎn)記錄，計算湖羊ESR不同基因型及基因的頻率。用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，對不同ESR基因型的湖羊產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行LSD多重比較，從而分析比較不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果表明其特異性良好（圖1），目的條帶長度符合預(yù)期，為419 bp左右，可直接進(jìn)行SSCP分析。

2.2SSCP檢測結(jié)果

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明ESR基因存在多態(tài)性，擴(kuò)增片段存在3種基因型，將其定義為CC、CG和GG（圖2）。其中第10道為CG，第5道為GG，其余幾道為CC。

2.3不同基因型測序結(jié)果

為確定ESR基因的突變位點，將CC、CG和GG基因型的PCR產(chǎn)物送無錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果可知，等位基因G與C相比，發(fā)生了1處突變（G363C），測序結(jié)果見圖3。[FL）]

[FL（2K2]2.4湖羊ESR基因型及基因頻率

檢測結(jié)果表明，在342只湖羊樣本中，193只是CC型，122只是CG型，27只是GG型。經(jīng)計算，C等位基因的頻率為0.743，G等位基因的頻率為0.257。CC基因型頻率為 0.564，CG基因型頻率為0.357，GG基因型頻率為0.079。

2.5湖羊ESR不同基因型的產(chǎn)羔數(shù)的均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

由表1可知，根據(jù)第1胎產(chǎn)羔記錄，GG與CC、CG產(chǎn)羔數(shù)差異顯著，CC、CG之間差異不顯著。根據(jù)第2胎湖羊產(chǎn)羔記錄，CC、CG、GG基因型的產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。從整體水平看，CC、CG、GG基因型的產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。[FL）]

3討論與結(jié)論

畢曉丹通過研究高繁殖力綿羊品種與低繁殖力綿羊品種的ESR基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)ESR基因外顯子1的第363處發(fā)生了C-G突變，在小尾寒羊中AB、BB基因型比AA基因型多產(chǎn)0.51、0.70只羔羊，并認(rèn)為ESR基因可能是控制小尾寒羊多胎的主效基因或與之存在緊密的連鎖[9]。董文艷等對湖羊ESR基因第一外顯子部分序列進(jìn)行多態(tài)性檢測[20]，結(jié)果與畢曉丹的研究結(jié)果[9]相似，ESR基因也發(fā)生了C-G的突變，并認(rèn)為ESR基因可能是控制湖羊多羔性能的1個主效基因或與之存在緊密遺傳連鎖的1個標(biāo)記。李廣錄以中國美利奴羊、湖羊、羅米麗羊和羅米麗×中國美利奴（新疆軍墾型）為研究對象，檢測其ESR基因的5′非翻譯區(qū)片段的多態(tài)性，結(jié)果顯示4種綿羊均出現(xiàn)多態(tài)性[10]。狄冉等采用PCR-[JP2]SSCP技術(shù)分析ESR基因外顯子4在高繁殖力綿羊品種（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力綿羊品種（特克塞爾、中國美利奴、考力代和杜泊）中的單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果顯示ESR基因在這6個綿羊品種中均不存在多態(tài)性，說明所檢測的ESR基因外顯子4序列可能不是影響綿羊高繁殖力的功能結(jié)構(gòu)域[22]。[JP]

本試驗使用的所有湖羊均來自江蘇省太倉金倉湖羊場，此羊場是新建羊場，羊群剛購進(jìn)不久，且未經(jīng)過選育，羊場只有湖羊第1、2胎的生產(chǎn)記錄。經(jīng)統(tǒng)計分析，本次試驗羊第1胎平均產(chǎn)羔1.86只，第2胎試驗羊平均產(chǎn)羔2.04只，此羊場湖羊的整體生產(chǎn)水平未達(dá)到通常文獻(xiàn)中報道的每胎 2.30 只羔羊。因此該羊場湖羊的群體構(gòu)成及其胎次因素可能會對本試驗結(jié)果造成一定影響。

本試驗結(jié)果顯示，檢測的342只湖羊中ESR基因存在多態(tài)性，分別為CG、CC和GG。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)ESR基因外顯子1的第363處發(fā)生了C-G突變。根據(jù)湖羊產(chǎn)羔數(shù)的統(tǒng)計分析結(jié)果可知，CG、CC、GG之間的產(chǎn)羔數(shù)并無顯著差異。而這一結(jié)果與畢曉丹等的研究結(jié)果[9，20]相悖，他們的研究結(jié)果表明，等位基因B（B等同于本試驗中的等位基因G）與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)。筆者認(rèn)為造成這一現(xiàn)象的原因，與上述提及的該羊場的羊群結(jié)構(gòu)以及胎次因素可能有關(guān)。湖羊是世界著名的多胎品種，其多胎性能是由多個主效基因控制的，本試驗只是單一地分析了ESR基因與湖羊多胎性能的關(guān)系。因此，要確定ESR基因與湖羊繁殖性能的確切關(guān)系，還應(yīng)進(jìn)行多基因的聯(lián)合分析，以尋找各個候選基因之間的聯(lián)系。就本研究而言，筆者認(rèn)為可以在后續(xù)試驗中進(jìn)一步獲取該羊場更多的胎次數(shù)據(jù)以及擴(kuò)大樣本數(shù)量，從而進(jìn)一步驗證ESR基因與湖羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系。

[JP3]本試驗表明，ESR基因多態(tài)性對湖羊產(chǎn)羔性能無顯著影響。[JP]

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