劉 康 崔 凱 李 瑞 馮海航 劉繼紅＊＊ 文 博, 饒 可＊＊

1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科（武漢 430030）；2. 南方醫(yī)科大學附屬深圳寶安醫(yī)院泌尿外科；3. 廣州醫(yī)科大學附屬深圳沙井醫(yī)院泌尿外科

·論 著·

1-磷酸鞘氨醇受體1-3在Ⅰ型糖尿病ED大鼠陰莖海綿體組織中的表達＊

劉 康1崔 凱1李 瑞1馮海航2劉繼紅1＊＊文 博2,3＊＊饒 可1＊＊

1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科（武漢 430030）；2. 南方醫(yī)科大學附屬深圳寶安醫(yī)院泌尿外科；3. 廣州醫(yī)科大學附屬深圳沙井醫(yī)院泌尿外科

目的 探討1-磷酸鞘氨醇受體1-3（S1PR1-3）在糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體組織中的表達。方法 20只成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組和糖尿病組, 成功造模2個月后，測定兩組大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓/平均動脈壓（Max ICP/MAP），采用Western blot分析S1PR1-3、eNOS、RhoA、ROCK1、ROCK2的表達。 結果 與對照組相比，糖尿病組大鼠勃起功能顯著降低（P＜0.05）；糖尿病組大鼠陰莖海綿體S1PR1、S1PR3、eNOS蛋白表達水平下降（P＜0.05），而S1PR2、RhoA、ROCK1、ROCK2的表達升高（P＜0.05）。結論 Ⅰ型糖尿病可導致大鼠勃起功能障礙，可能與S1PR1、S1PR3表達下調，eNOS/NO/cGMP信號通路受抑制以及S1PR2受體表達升高，激活RhoA/Rho激酶信號通路有關。

1-磷酸鞘氨醇受體; rho相關激酶類; 一氧化氮合酶; 勃起功能障礙; 糖尿病

糖尿病是引起男性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）最常見的危險因素之一。據(jù)報道，約30%～80%糖尿病患者患有不同程度ED，患病率是正常男性的3倍，而且糖尿病患者出現(xiàn)勃起功能障礙的時間較正常男性提前約10年，其癥狀也更加嚴重，對患者的生活質量造成嚴重影響[1,2]。1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）和1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR）在人體的心血管、內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)等多個系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[3]，目前，1-磷酸鞘氨醇及其受體在ED的機制研究中逐漸受到重視，在高血壓、神經(jīng)損傷、雄激素缺乏等誘導ED中均發(fā)現(xiàn)S1PR1-3的表達異常[4-6]，而陰莖海綿體組織中S1PR1-3的表達在糖尿病誘導ED中的作用機制尚不清楚，本實驗比較S1PR1-3在糖尿病大鼠及正常大鼠陰莖海綿體組織中的表達，研究S1PR1-3與糖尿病誘導ED的關系以及其對大鼠勃起功能的影響。

資料和方法

（一）實驗動物

8周齡無特異病原（specific-pathogen-free, SPF）雄性sprague-dawley（SD）大鼠20只，均購自湖北省疾病預防控制中心，體質量為180～210g，在同一SPF無菌環(huán)境下正常飼養(yǎng)適應1周，隨機分為兩組。正常對照組（CO）8只，予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)；糖尿?。―M）組12只，禁食12h后，予以60mg/kg鏈佐菌素（STZ）腹腔注射，給藥后禁水不禁食4h。腹腔注射72h后，取尾靜脈血測量血糖≥16.7mmol/L提示造模成功，造模成功大鼠可見明顯多飲多尿癥狀，注意精心喂養(yǎng)，勤換墊料，防止感染死亡，8周后正常對照組大鼠全部存活，糖尿病大鼠體質量明顯減輕，毛色晦暗，2只大鼠因腹腔感染死亡。

（二）主要試劑及儀器

鏈佐菌素（streptozotocin, STZ）、檸檬酸、檸檬酸鈉（Sigma公司，美國），STZ溶液的配置：取適量STZ溶解到0.1mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.2），終濃度為1%，即配即用；eNOS抗體（Abcam 公司，英國）；RIPA裂解液（江蘇碧云天生物公司）；S1PR1抗體、 S1PR2抗體、RhoA抗體、ROCK1抗體、ROCK2抗體、β-actin（武漢三鷹生物技術有限公司）；S1PR3抗體（Santa Cruz公司,美國）；羊抗兔和羊抗鼠二抗（武漢科瑞生物科技有限公司）；羅氏血糖儀及試紙（ACCU-CHEK）；Powerlab四通道生理記錄儀（AD Instruments 公司，澳大利亞）。

二、實驗方法

（一）體質量及血清學檢測

所有大鼠購回適應飼養(yǎng)一周，隨機分組之后禁食12h，測量體質量，使用羅氏血糖儀（ACCUCHEK）采取斷尾取血法測量空腹血糖；16周齡時，同樣方法再次測量兩組大鼠體質量及空腹血糖值。

（二）陰莖海綿體內(nèi)壓/平均動脈壓（Max ICP/ MAP）測定

在甘南，鄭軍里碰到了藏區(qū)牧民中難得一見的“轉場”遷徒，各種生動感人甚至壯觀浩蕩的人情牧歌都在其中了。從準備到啟程、遠征，這種場面都是生活在那個地區(qū)的人們難得一見的壯舉，想必這對鄭軍里的視覺和心靈有很大的震撼。毫無疑問，這批作品即以“轉場”為中心，描繪了他見到的感興趣的藏區(qū)牧民們的人情生活，有著向往遠方的牧歌情調?！兑宦废蛭鳌贰洱R心協(xié)力奔遠方》《陽剛》等都表現(xiàn)了這種特定場面中的壯觀與抒情。那種新生活的小趣味也盡在其中，如現(xiàn)在牧民女的通訊與娛樂也離不開手機了，持手機放牧的《音訊傳來》即描繪了這種生活。

參照本課題組已報道的實驗方法[7]。大鼠麻醉后，進行頸總動脈插管，連接壓力換能器并由PowerLab/4SP 系統(tǒng)（AD Instrument 澳大利亞）采集信號，之后，暴露海綿體神經(jīng)，作為電刺激部位，將穿刺針插入陰莖海綿體固定并連接壓力換能器，采集信號。連接PowerLab工作臺，設置電刺激參數(shù)為頻率15Hz、脈沖1.2ms，分別給予2.5V、5V、7.5V電壓刺激海綿體神經(jīng)，每次1min，間隔為3min。記錄2.5V、5V、7.5V電壓下海綿體壓力（ICP）及平均動脈壓（MAP），結果以Max ICP/MAP表示。

（三）Western印跡測定S1PR1-3、eNOS、RhoA、ROCK1及ROCK2在大鼠陰莖海綿體組織中的表達

參照本課題組前期實驗采用的方法[7]。一抗選用兔抗大鼠S1PR1（1:500）、S1PR2（1:500）、S1PR3（1:500）、eNOS（1:1000）、RhoA（1:500）、ROCK1（1:1000）、ROCK2（1:1000）抗體，鼠抗大鼠β-actin（1:1000）抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1:5000），采用ECL化學發(fā)光并采集圖像進行處理，使用QuantityOne軟件分析圖像結果。

三、統(tǒng)計學分析

實驗結果以x±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗，用SPSS 22.0軟件進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、實驗前后兩組大鼠體質量、血糖比較

兩組大鼠飼養(yǎng)適應1周，實驗前，測量兩組大鼠體質量及血糖并比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。鏈佐菌素注射后，兩組大鼠均飼養(yǎng)8周，糖尿病組大鼠因感染死亡2只，體質量較正常對照組大鼠明顯減輕，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。糖尿病大鼠血糖水平明顯高于正常對照組大鼠，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

二、兩組大鼠Max ICP/MAP比

分別用2.5V、5V、7.5V電壓刺激大鼠海綿體神經(jīng)，電壓刺激時糖尿病組較正常對照組Max ICP/MAP顯著降低（P＜0.05）。圖1是各組大鼠在2.5V、5V、7.5V刺激下海綿體測壓的ICP和MAP的監(jiān)測記錄和比較結果。

二、Western印跡測定兩組大鼠陰莖海綿體組織中S1PR1-3、eNOS、RhoA、ROCK1及ROCK2的表達水平

結果顯示：糖尿病組S1PR2、RhoA、ROCK1和ROCK2較正常對照組明顯增高，而S1PR1、S1PR3及eNOS水平明顯低于正常對照組（均P＜0.05），見圖2和圖3。

表1 兩組大鼠實驗前后體質量及血糖比較

圖1 2.5V、5V、7.5V電刺激后兩組大鼠陰莖海綿體內(nèi)Max ICP/MAP比值變化

圖2 S1PR1-3在兩組大鼠陰莖海綿體中的表達

圖3 eNOS、RhoA/Rho激酶在兩組大鼠陰莖海綿體中的表達

討 論

勃起功能障礙是成年男性的常見疾病，與ED有關的危險因素包括：年齡增長、軀體疾?。ㄈ绺哐獕?、糖尿病、高脂血癥、肥胖、神經(jīng)疾病等）、精神心理因素、用藥史、手術外傷史及不良的生活方式等。40～70歲男性有一半以上患有不同程度的ED，嚴重影響患者的生活質量[8]。現(xiàn)有的研究表明，ED的發(fā)生機制極其復雜，涉及眾多信號通路，如NO/cGMP信號通路、RhoA/Rho激酶信號通路、cAMP信號通路、H2S、CO、K+通道、血管活性腸肽、降鈣素基因相關肽、前列腺素、內(nèi)皮素等均參與陰莖海綿體平滑肌的舒張和收縮[9]。目前認為NO/cGMP通路在陰莖勃起中起主要作用，而eNOS主要分布于血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞，是陰莖海綿體中NO的重要來源?？梢哉J為eNOS對松弛陰莖海綿體平滑肌促進陰莖勃起起著至關重要的作用。而RhoA/Rho激酶信號通路參與多種危險因素誘導ED的發(fā)生過程[10]，對陰莖海綿體平滑肌收縮，維持陰莖疲軟起著關鍵作用[11]。在糖尿病大鼠中，陰莖海綿體組織中eNOS表達下降，同時RhoA/Rho激酶信號通路上調，陰莖海綿體平滑肌收縮因素增強而舒張因素減弱，從而導致ED的發(fā)生。

S1P是一種具有重要生理功能的兩性生物信號分子，主要分布于血液、淋巴液等體液以及各類血細胞中，既可以在細胞內(nèi)作為第二信使直接調節(jié)生物學行為，也可以被分泌到細胞外，結合其相應表面受體，調節(jié)各種生理活動。S1P受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，包括S1PR1～S1PR5，與G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用[12]。

S1P與S1PR1結合，可以誘導內(nèi)皮細胞生成NO，起到舒張血管的作用。di Villa Bianca等[13]對人體陰莖組織的研究發(fā)現(xiàn)，S1P是通過調節(jié)eNOS磷酸化，增加NO的合成與釋放，促進陰莖的勃起。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細胞中，S1P/S1PR1可以通過激活PI3K/ Akt信號通路，上調eNOS表達，增加NO含量，最終舒張血管平滑肌[14]。在去勢大鼠模型和自發(fā)性高血壓大鼠模型中，均發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體組織S1PR1、eNOS及P-eNOS表達降低[4,6]。本實驗在糖尿病大鼠中也有類似變化，S1PR1、eNOS表達均明顯低于正常對照組，由此推測可能機制為Ⅰ型糖尿病大鼠陰莖海綿體組織中S1PR1表達降低，從而抑制eNOS/NO/cGMP信號通路，最終致使大鼠ED的發(fā)生。

S1PR2在體內(nèi)的分布與S1PR1類似，但S1PR2在成年期機體的血管平滑肌組織中的表達較S1PR1高，作用更突出。在平滑肌細胞中，S1P結合S1PR2與G12/13蛋白偶聯(lián)后，可以激活RhoA/Rho激酶信號通路，促進肌球蛋白輕鏈磷酸化，導致血管平滑肌收縮[15]；在內(nèi)皮細胞中，S1P結合S1PR2后可抑制PI3K/Akt信號通路，進而下調eNOS表達，導致NO生成減少，血管平滑肌舒張受阻[16]；此外，S1P/S1PR2還可以通過增加磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1 /2（pERK1/2）的表達，激活L型鈣通道（L- Ca2+）使細胞內(nèi)Ca2+升高，同時抑制eNOS活性，減少NO合成[17]。對去勢大鼠勃起功能研究發(fā)現(xiàn)，S1PR2、RhoA、ROCK1、ROCK2在陰莖海綿體組織中表達均增加[7]。在糖尿病大鼠模型中，本實驗也發(fā)現(xiàn)相同的變化，我們推測，S1P與S1PR2結合之后，一方面可以激活RhoA/Rho激酶信號通路，另一方面，可以抑制PI3K/Akt信號通路和pERK1/2途徑，進而抑制eNOS表達，降低NO含量，損害勃起功能。

S1PR3具有雙向調節(jié)作用，既可以通過PI3K/Akt信號通路促進eNOS磷酸化，增加NO合成和釋放，起到舒張血管的作用，也可以通過激活Rho相關信號通路導致血管收縮。在自發(fā)性高血壓大鼠模型和去勢大鼠模型研究中，S1PR3在陰莖海綿體中的表達均明顯高于對照組[4]，而本實驗中，糖尿病大鼠組S1PR3表達明顯低于對照組，eNOS水平同樣較對照組降低。根據(jù)以上研究，我們認為，在Ⅰ型糖尿病大鼠體內(nèi)，陰莖海綿體組織中S1PR3 表達下降，導致eNOS含量降低，最終影響勃起功能。

本實驗具有一定的局限性，對于S1P/S1PR如何調控各信號通路沒有進行深入的探索，而且，實驗中沒有進行干預治療，如果能夠使用相應受體的激動劑或者抑制劑或是采用分子生物學方法進行干預，將會使我們對S1P/S1PR與Ⅰ型糖尿病ED的關系有更加清晰的認識；此外，本實驗還缺少細胞水平研究，進一步驗證體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)。我們將在后續(xù)研究中逐漸完善這些內(nèi)容。

綜上所述，Ⅰ型糖尿病引起勃起功能障礙可能與陰莖海綿體組織內(nèi)S1PR1、S1PR3表達下調，eNOS/ NO/ cGMP信號通路受抑制以及S1PR2表達升高，激活RhoA/Rho激酶信號通路有關。S1PR1-3可能是糖尿病誘導ED發(fā)生過程中調節(jié)NO/cGMP信號通路和RhoA/Rho激酶信號通路的一個重要調控位點。本實驗為研究糖尿病誘導ED發(fā)生機制及治療提供了新的思路。

1 Johannes CB, Araujo AB, Feldman HA, et al. Incidence of erectile dysfunction in men 40 to 69 years old: longitudinal results from the Massachusetts male aging study. J Urol 2000; 163(2): 460-463

2 Phé V, Rouprêt M. Erectile dysfunction and diabetes: A review of the current evidence-based medicine and a synthesis of the main available therapies. Diabetes Metab 2012; 38(1): 1-13

3 Maceyka M, Harikumar KB, Milstien S, et al. Sphingosine-1-phosphate signaling and its role in disease. Trends Cell Biol 2012; 22(1): 50-60

4 Wang B, Jiang J, Fan Z, et al. Expression of sphingosine-1-phosphate 1-3 on penile cavernous tissue in hypertensive and normotensive rats. Urology 2014; 84(2): 490 e7-e13

5 Cho MC, Park K, Chai JS, et al. Involvement of sphingosine-1-phosphate/RhoA/Rho-kinase signaling pathway in corporal fibrosis following cavernous nerve injury in male rats. J Sex Med 2011; 8(3):712-21.

6 陳學勤, 夏紀毅, 程波, 等. 1-磷酸鞘氨醇受體1-3(S1P1-3)在去勢雄性大鼠陰莖海綿體組織中的表達. 中華男科學雜志 2016; 22(5): 393-400

7 崔凱, 李瑞, 王濤, 等. 雄激素調控RhoA/Rho激酶改善去勢大鼠勃起功能障礙的機制研究. 華中科技大學學報?醫(yī)學版 2016; 45(2): 145-148, 153

8 Maeda H, Toyooka N, Kinukawa T, et al. Magnetic resonance images of hematospermia. Urology 1993; 41(5): 499-504

9 劉繼紅, 欒陽. 男性勃起功能障礙的分子生物學研究進展. 中華男科學雜志 2015; 21(2): 99-106

10 饒可, 劉繼紅. Rhoa/Rho激酶在男性勃起功能障礙機制中的研究進展. 中國男科學雜志 2008; 22(11): 65-67, 71

11 Sopko NA, Hannan JL, Bivalacqua TJ. Understanding and targeting the Rho kinase pathway in erectile dysfunction. Nature Reviews. Nat Rev Urol 2014; 11(11): 622-628

12 Blaho VA, Hla T. An update on the biology of sphingosine 1-phosphate receptors. J lipid Res 2014; 55(8): 1596-1608

13 di Villa Bianca Rd, Sorrentino R, Sorrentino R, et al. Sphingosine 1-phosphate induces endothelial nitric-oxide synthase activation through phosphorylation in human corpus cavernosum. J Pharmacol Exp Ther 2006; 316(2): 703-708

14 Kimura T, Tomura H, Mogi C, et al. Role of scavenger receptor class B type I and sphingosine 1-phosphate receptors in high density lipoprotein-induced inhibition of adhesion molecule expression in endothelial cells. J Biol Chem 2006; 281(49): 37457-37467

15 Watterson KR, Ratz PH, Spiegel S. The role of sphingosine-1-phosphate in smooth muscle contraction. Cell Signal 2005;17(3): 289-298

16 Liu W, Liu B, Liu S, et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 2 mediates endothelial cells dysfunction by PI3K-Akt pathway under high glucose condition. Eur J Pharmacol 2016; 776: 19-2517 Liu W, Lan T, Xie X, et al. S1P2 receptor mediates sphingosine-1-phosphate-induced fibronectin expression via MAPK signaling pathway in mesangial cells under high glucose condition. Exp Cell Res 2012; 318(8): 936-943

（2017-01-28收稿）

Expressions of sphingosine-1-phosphate receptors 1-3 in the cavernous tissues of diabetes mellitus ED rats＊

Liu Kang1, Cui Kai1, Li Rui1, Feng Haihang2, Liu Jihong1＊＊, Wen Bo2,3＊＊, Rao Ke1＊＊

1. Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei, China; 2. Department of Urology, the People's Hospital of Baoan District, Southern Medical University; 3. Department of Urology, the People's Hospital of Shajing District, Guangzhou Medical University;

Corresponding author: Liu Jihong, E-mail: jhliu@tjh.tjmu.edu.cn;

Wen Bo, E-mail: Tjwb001@126.com; Rao Ke, E-mail: raokeke2009@163.com

Objective To investigate the expressions of sphingosine-1-phosphate receptors 1-3 in the cavernous tissues of diabetes mellitus-induced erection dysfunction rats and its molecular mechanism. Methods 20 eight-week-old healthy male SD rats were randomly divided into 2 groups: Control Group (CO, n=8) and Diabetes mellitus group (DM, n=12,). Diabetes rats were firstly constructed. After 2 months, the maximum intracavernous pressure/mean arterial pressure (Max ICP/MAP) of rat models were determined and the expressions of S1PR1-3、eNOS、RhoA、ROCK1 and ROCK2 in the penis were detected by Western blot. Results The erectile function was significantly decreased in DM rats, compared to that of age-matched control rats (P＜0.05); the expressions of S1PR1、S1PR3 and eNOS were lower in group DM than those in group CO (P＜0.05), whereas the expressions of S1PR2、RhoA、ROCK1、ROCK2 were higher in group DM (P＜0.05). Conclusion Diabetes mellitus could result in significant reduction of Max ICP/MAP in male rats. Lower expressions of S1P1and S1PR3 in the penis and inhibition of the eNOS/NO/cGMP signaling pathways, as well as higher expression of S1PR2 and activation of the RhoA/Rho kinase signaling pathways may contribute to this pathological process.

sphingosine-1-phosphate receptors; rho-Associated Kinases; Nitric Oxide Synthase ; erectile dysfunction; Diabetes Mellitus

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.001

R698.1; R587.1

資助：深圳市科技計劃項目（JCYJ20160427190559022）

＊＊通訊作者：劉繼紅，E-mail: jhliu@tjh.tjmu.edu.cn；文博，E-mail: Tjwb001@126.com；饒可，E-mail: raokeke2009@163.com