肖艷平，付久園，王哲，葛永梅，裴美麗

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2獻(xiàn)縣人民醫(yī)院；3寬城縣醫(yī)院)

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其機(jī)制

肖艷平1，付久園1，王哲2，葛永梅1，裴美麗3

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000；2獻(xiàn)縣人民醫(yī)院；3寬城縣醫(yī)院)

目的探討腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo增殖和侵襲的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法將HTR-8/Svneo細(xì)胞分成A、B、C組，A組加入1 mL/L DMSO，B組加入5×10-8g/mL的BDNF，C組加入0.1 μmol/L的BDNF絡(luò)氨酸激酶受體TrkB特異性抑制劑K252a，24 h后轉(zhuǎn)板繼續(xù)培養(yǎng)。采用CCK8法觀察3組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48及72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力(以O(shè)D450表示)，采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察3組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h時(shí)的侵襲能力(以穿膜細(xì)胞數(shù)表示)，采用Western blotting法檢測(cè)3組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h時(shí)磷酸化TrkB(p-TrkB)和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)。結(jié)果繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h時(shí)B組細(xì)胞OD450均高于A組(P均<0.05)，C組細(xì)胞OD450均低于A組(P均<0.05)。A、B、C組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(42±4)、(87±6)、(29±3)個(gè)。B組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)多于A組(P<0.05)，C組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少于A組(P均<0.05)。與A組相比，B組細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)量均升高(P均<0.05)，C細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR表達(dá)量均降低(P均<0.05)。結(jié)論BDNF可以增強(qiáng)人滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo增殖和侵襲能力，其機(jī)制可能與其活化PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；人滋養(yǎng)層細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

妊娠期間胎盤(pán)的成功形成和維持依靠對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲能力的嚴(yán)格調(diào)控[1]。滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠?qū)⑻汉湍阁w組織分隔開(kāi)并充當(dāng)兩者物質(zhì)交換的通道，為胎盤(pán)提供物理支撐的同時(shí)可保護(hù)胎兒免受母體免疫排斥反應(yīng)的傷害[2，3]。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能異常會(huì)引起多種妊娠疾病的發(fā)生，嚴(yán)重威脅母嬰的健康。研究表明，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)與其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)在神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[4，5]，但目前有關(guān)其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲能力影響的研究少見(jiàn)。本研究以人源妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo為研究對(duì)象，探討B(tài)DNF對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自HYCLONE公司，血清購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)、0.25%胰酶消化液、CCK-8試劑、RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶公司，BDNF購(gòu)自ProSpec公司，TrkB的特異性抑制劑K252a購(gòu)自MCE公司，兔抗人磷酸化TrkB(p-TrkB)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)一抗及HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自Proteintech公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司。HTR-8/SVneo細(xì)胞為本科室保存。

1.2 細(xì)胞分組及BDNF應(yīng)用 HTR-8/SVneo細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)(血清濃度為10%，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 g/L)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，制備單細(xì)胞懸液，種植到6孔板，將細(xì)胞分成A、B、C組，A組加入1 mL/L DMSO，B組加入5×10-8g/mL的BDNF，C組加入0.1 μmol/L的BDNF絡(luò)氨酸激酶受體TrkB特異性抑制劑K252a，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 三組細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。3組細(xì)胞處理24 h后，制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取100 μL細(xì)胞懸液，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)種到96孔板中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，分別在第0、24、48、72 h檢測(cè)一次細(xì)胞活力。每次檢測(cè)前每孔加10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀用450 nm激發(fā)光檢測(cè)光密度值(OD450)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 三組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell法。將Matrigel膠100 μL加至24孔板的Transwell上室，37 ℃放置4 h。吸掉小室中的液體，上下室分別加入100、600 μL無(wú)血清培養(yǎng)液，37 ℃放置30 min后吸去培養(yǎng)基。將處理24 h后的3組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液各100 μL加至上室，使細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，下室加入600 μL的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液。進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h后，擦掉上室中的細(xì)胞和基質(zhì)膠，清洗上下室，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，切下基底膜觀察，拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 三組細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR檢測(cè) 采用Western blotting法。收集3組細(xì)胞，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制劑)裂解提取蛋白，BCA法測(cè)定濃度后，95 ℃加熱5 min。垂直電泳槽內(nèi)每孔內(nèi)加入約20 μg蛋白，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗人p-TrkB、p-Akt和p-mTOR一抗4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后加ECL顯色。以β-tubulin為內(nèi)參照。采用Image J v1.48中文版軟件分析圖像，以目的蛋白條帶灰度/β-tubulin條帶灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞OD450比較 繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h三組細(xì)胞OD450見(jiàn)表1。繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h時(shí)B組細(xì)胞OD450均高于A組(P均<0.05)，C組細(xì)胞OD450均低于A組(P均<0.05)。

表1 不同時(shí)點(diǎn)三組細(xì)胞OD450值比較

注：與A組比較，aP<0.05。

2.2 三組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 A、B、C組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(42±4)、(87±6)、(29±3)個(gè)。B組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)多于A組(P<0.05)，C組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少于A組(P均<0.05)。

2.3 三組細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR比較 三組細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR表達(dá)量見(jiàn)表2。與A組相比，B組細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)量均升高(P均<0.05)，C細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR表達(dá)量均降低(P均<0.05)。

表2 組細(xì)胞p-TrkB、p-Akt、p-mTOR比較

注：與A組比較，aP<0.05。

3 討論

BDNF是一種腦源性生長(zhǎng)因子，主要由神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，在腦組織中廣泛分布，在維持早期胚胎神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化和脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)分發(fā)育中發(fā)揮重要作用。TrkB是BDNF的特異性受體，由一條單跨膜肽鏈組成。當(dāng)TrkB與BDNF結(jié)合后，TrkB自身發(fā)生磷酸化，活化的TrkB能夠繼續(xù)向下傳導(dǎo)信號(hào)，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸脂酶C-γ(PLC-γ)信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的各項(xiàng)功能[6，7]。目前，BDNF/TrkB信號(hào)通路的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)[8]。近年來(lái)在其他組織的細(xì)胞中也廣泛發(fā)現(xiàn)了BDNF的表達(dá)，BDNF/TrkB信號(hào)通路也越來(lái)越多地被引入到其他領(lǐng)域的研究[9-10]，但目前尚少見(jiàn)BDNF對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞影響的研究。

穩(wěn)定的HTR-8/SVneo細(xì)胞系模型的建立可為妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞分化的細(xì)胞生物學(xué)研究提供一個(gè)可靠有效的模型。HTR-8/SVneo細(xì)胞的生理功能與早孕絨毛層細(xì)胞基本一致，故被廣泛應(yīng)用。本研究以HTR-8/SVneo細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，結(jié)果顯示，與A組相比，外源性BDNF對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖和侵襲能力有顯著的促進(jìn)作用，而用特異性TrkB抑制劑K252a切斷BDNF/TrkB信號(hào)通路后，HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖和侵襲能力皆被抑制，提示BDNF/TrkB信號(hào)通路參與影響了滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，BDNF處理后細(xì)胞TrkB的磷酸化水平增加，而抑制劑K252a處理后，TrkB的磷酸化水平受到抑制，表明人為的刺激可以成功控制BDNF/TrkB信號(hào)通路的活化。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是影響細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生理活動(dòng)的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。本研究通過(guò)進(jìn)一步對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)BDNF處理上調(diào)p-TrkB的水平后，p-Akt和p-mTOR的表達(dá)水平也相應(yīng)上調(diào)。故推測(cè)在滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo中，BDNF可能是通過(guò)影響PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo功能的影響。

綜上所述，外源添加BDNF可通過(guò)影響PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化增加滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的增殖和侵襲能力，這將有助于后續(xù)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的研究。

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