連大衛(wèi)，許藝飛，扶麗君，任文康，魏文輝，莊惠玲，黃 萍，操紅纓

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510405)

廣藿香醇對幽門螺桿菌酸抵抗能力的影響及其機制探討

連大衛(wèi)，許藝飛，扶麗君，任文康，魏文輝，莊惠玲，黃 萍，操紅纓

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510405)

目的觀察廣藿香醇對于幽門螺桿菌(Hp)酸抵抗能力的影響，并探討其機制。方法體外培養(yǎng)并鑒定Hp后隨機分為5組，受試藥高、中、低劑量組分別加入20、10、5 mg/L廣藿香醇，陽性對照組加入尿素酶(Ure)抑制劑AHA，空白對照組加入等體積DMSO；干預(yù)0.5 h后應(yīng)用瓊脂稀釋法測定Hp菌落數(shù)，觀察其抗酸能力。通過大腸桿菌系統(tǒng)表達和純化得到Hp尿素酶A(UreA)、UreB、UreG，取UreA/UreB蛋白混合溶液體外模擬Ure成熟過程，將UreG蛋白單體溶液和鎳離子(Ni2+)溶液混合，均分別以20、10、5 mg/L廣藿香醇(受試藥高、中、低劑量組)和等體積DMSO處理(對照組)；采用Berthelot顯色法檢測Ure活性，判斷Ure成熟度；以原子吸收光譜法檢測Ni2+濃度，判斷UreG攜帶Ni2+的能力。結(jié)果在中性環(huán)境中，受試藥各劑量組和陽性對照組與空白對照組Hp菌落數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異；在酸性環(huán)境中，受試藥各劑量組和陽性對照組均較空白對照組Hp菌落數(shù)減少(P均<0.01)，且受試藥高劑量組、陽性對照組<受試藥中劑量組<受試藥低劑量組(P均<0.01)。受試藥高、中、低劑量組和對照組Ure活性分別為54.89%±11.47%、63.99%±9.46%、83.88%±11.81%、101.53%±2.55%，Ni2+濃度分別為(0.77±0.24)、(0.80±0.22)、(1.12±0.35)、(1.56±0.42)μmol/L，受試藥高、中劑量組<受試藥低劑量組<對照組(P均<0.01)。結(jié)論廣藿香醇可以降低Hp的酸抵抗能力，可能與阻斷Ni2+的傳遞途徑和Ure的成熟過程進而抑制Ure活性有關(guān)。

幽門螺桿菌；酸抵抗；廣藿香醇；尿素酶成熟；鎳離子傳遞

據(jù)調(diào)查顯示[1]，在幽門螺桿菌(Hp)的高感染地區(qū)，慢性胃炎與Hp感染呈正相關(guān)，若不根除體內(nèi)Hp則發(fā)生消化道潰瘍或胃癌的概率顯著增加?？崭範顟B(tài)下人體胃液的pH在1左右，而Hp只能生存于中性或弱酸性環(huán)境中；所以，Hp進入宿主的胃部后必須迅速游動到胃酸較少的胃竇處，黏附于上皮細胞并發(fā)揮酸抵抗的功能[2]。這種機制可以讓Hp在外周低pH的環(huán)境中維持細菌體內(nèi)的pH在4～5，保證其生存。其中，尿素酶(Ure)屬于一種鎳離子(Ni2+)依賴金屬酶，占據(jù)細菌可溶性蛋白的10%～15%，發(fā)揮分解尿素生成氨的作用，可在Hp周圍形成一片“氨云”，是Hp具有酸抵抗特性最重要的蛋白酶[3,4]。因此，Hp高表達成熟的Ure是維持細菌生存定植的最重要因素[5]。廣藿香醇是廣藿香的主要有效成分[6]，其藥理作用包括抗氧化、抗炎及殺滅細菌、真菌、寄生蟲等[7～9]。2016年8月～2017年4月，我們觀察了廣藿香醇對于Hp耐酸性和Ure成熟途徑的影響，為進一步研究廣藿香醇清除體內(nèi)Hp的機制提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Hp(SS1)由澳大利亞莫納什大學(xué)Richard Ferrero教授饋贈；感受態(tài)細菌BL21(DE3)，表達載體質(zhì)粒DNA(UreA和UreB)基因序列的設(shè)計與優(yōu)化由德泰生物(南京)有限公司完成；表達載體質(zhì)粒DNA(UreG)由香港中文大學(xué)黃錦波教授課題組提供。廣藿香醇(HPLC>98%)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究與開發(fā)中心蘇子仁教授提供；臨用前用溶解于DMSO，配制成20 mg/L的母液保存于4 ℃冰箱中，實驗前再稀釋成20、10、5 mg/L的含藥BHI培養(yǎng)液。

彎曲桿菌瓊脂培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific)；無菌脫纖維羊血(青島雅各化學(xué)試劑有限公司)；腦浸心培養(yǎng)基 (Thermo Fisher Scientific)；革蘭染色液試劑盒(海博生物)；快速Ure試劑(上海榕柏生物技術(shù)有限公司)；異丙基硫代半乳糖苷(Biocolor)；40%丙烯酰胺(BIO-RAD)； 咪唑(Bomei)；HisPur Ni-NTA 離心柱(Thermo)，硫酸卡那霉素(Biosharp)；UreA/B抗體(Abcom)；尿素(Amresco)；GTPγS(Sigma)；鎳標準溶液(國家標準物質(zhì)研究中心)；6～8 kDa透析袋(Spectrum)；溶菌酶、LB培養(yǎng)基(Sigma)；Ure抑制劑乙酰氧肟酸(AHA，Sigma)。

全波長酶標儀(TECAN)；超聲裂解儀(New Brunswick Scientific)；恒溫搖床(New Brunswick Scientific)；恒溫金屬浴鍋 (Benchmark)；冷凍離心機、小型抽真空機、pH檢測儀(Becmkan Coulter)；蛋白純化系統(tǒng)(Akta，美國)；恒壓壓力泵(Akta)；紫外吸收檢測器(Eppendorf)；AA-7000原子吸收光譜(Shimadzu)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hp培養(yǎng)及菌株鑒定 Hp(SS1)菌株復(fù)蘇于以彎曲桿菌瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含7%脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素(萬古霉素10 mg/L，甲氧芐氨嘧啶5 mg/L、頭孢磺啶5 mg/L、兩性霉素5 mg/L) 的固體培養(yǎng)基上，在微需氧(37 ℃，5% O2，10% CO2，85% N2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h?？焖賃re方法鑒定：使用接種環(huán)刮取少量Hp，轉(zhuǎn)移至快速Ure試劑液中，在37 ℃孵育4 h后觀察試劑顏色變?yōu)樽霞t色。形態(tài)學(xué)鑒定：使用接種環(huán)刮取少量Hp，用少量蒸餾水將細菌在載玻片上均勻涂抹開后，使用革蘭染色液對細菌染色，油鏡下觀察Hp形態(tài)呈紅色彎曲桿狀、無球變。

1.2.2 Hp酸抵抗能力觀察 采用酸性沖擊實驗。收集傳代后生長良好的Hp菌落，使用麥氏比濁儀調(diào)整密度為1×109CFU/mL，再按1∶9的比例分別將其置于酸性(pH=1.0)和中性(pH=7.0)的液體培養(yǎng)基中(以腦浸心培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含10%胎牛血清和250 mmol/L尿素)，使最終細菌密度為1×108CFU/mL；將酸性和中性菌液分別平均分為5組，受試藥高、中、低劑量組分別加入20、10、5 mg/L廣藿香醇，陽性對照組加入Ure抑制劑AHA 5 mmol/L，空白對照組加入等體積DMSO。在微需氧環(huán)境中培養(yǎng)30 min，取出500 μL菌液按照1∶1～1∶105等比例稀釋；再每個濃度取出100 μL接種于固體培養(yǎng)基中，微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h后計數(shù)Hp菌落。Hp菌落數(shù)越多，表明Hp酸抵抗能力越強。

1.2.3 UreA、UreB、UreG在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達與純化 分別將100 ng 的UreA、UreB、UreG表達載體質(zhì)粒DNA 直接加入感受態(tài)細菌BL21(DE3)中，輕微搖動混和后置于冰水浴中30 min；取出后放入42 ℃水浴鍋中熱激90 s，迅速放回冰水浴中3 min；復(fù)溫后加入200 μL 的LB 培養(yǎng)基中，放入搖床(37 ℃，195 r/min) 生長 60 min。吸取50 μL 懸液均勻涂布含有50 μg/mL 的硫酸卡那霉素LB 平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化平板中接種單克隆，加入含50 μg/mL硫酸卡那霉素12 mL的LB 培養(yǎng)基中，放入搖床(37 ℃ ，200 r/min)培養(yǎng)4 h；待培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，取出樣品檢測其OD600約為0.6。向試管培養(yǎng)液中加入異丙基硫代半乳糖苷(終濃度0.5 mmol/L)，15 ℃誘導(dǎo)過夜。重懸細菌，在冰浴中超聲裂解(每次超聲3 s，間歇8 s，總計20 min)；4 ℃以13 000 r/min離心30 min，保留上清并用0.45 μm 濾膜過濾；將過濾的上清液加入HisPur Ni-NTA 分離柱中置于旋轉(zhuǎn)混合儀上于4 ℃孵育80 min，用含有100 mmol/L的咪唑的緩沖液洗脫目標蛋白，流速控制在1.5 mL/min。

1.2.4 UreA、UreB、UreG的鑒定 收集UreA和UreB的洗脫液組分，采用SDS-PAGE凝膠電泳和Western blotting法鑒定。取牛血清白蛋白(BSA)作為對照，BSA及目標蛋白UreA、UreB分別取50 μL，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，迅速在100 ℃加熱樣品15 min 使蛋白變性；4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液20 μL加入凝膠槽中；以200 V 穩(wěn)壓電泳至溴酚藍帶遷移至離凝膠底部1 cm，取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色；隨后轉(zhuǎn)入脫色液中，脫色至背景清晰。同樣條件電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉3 h后分別加入1∶5 000稀釋的UreA、UreB抗體，4 ℃孵育過夜。用PBS沖洗3次，再加入1∶4 000稀釋的HRP羊抗兔IgG孵育2 h；最后用ECL化學(xué)增強發(fā)光試劑盒曝光、顯影，鑒定目的蛋白為UreA和UreB。收集UreG洗脫成分并過直徑0.22 μm的膜，再注入AKTA系統(tǒng)之中進行鑒定；收集UreG蛋白單體附近的組份，加入上樣緩沖液后迅速在95 ℃加熱樣品10 min 使蛋白變性；取20 μL加入凝膠槽之中，以恒流50 A電泳60 min，至溴酚藍帶遷移至離凝膠底部1 cm；取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色，隨后轉(zhuǎn)入脫色液中，脫色至背景清晰，觀察結(jié)果為UreG蛋白單體形式。

1.2.5 Hp中Ure成熟過程觀察 取等濃度的UreA和UreB蛋白溶液，按照2∶1混合后制備成Ure復(fù)合前體，隨機分為4組。受試藥高、中、低、劑量組分別加入20、10、5 mg/L的廣藿香醇，對照組加入等體積的DMSO；各組再加入NiSO4使Ni2+終濃度為0.1 mol/L，在37 ℃環(huán)境中孵育2 h。取各組反應(yīng)液加入等體積尿素溶液(10 mmol/L)混勻，在室溫避光條件下反應(yīng)20 min；然后依次加入配制的Berthelot顯色液A液和B液[10]，混勻后室溫顯色10 min；吸取反應(yīng)液，在酶標儀上檢測其OD635的吸光度值，計算Ure活性。Ure活性=(OD樣本-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。Ure活性越高，其成熟度越高。

1.2.6 Hp中UreG結(jié)合Ni2+能力觀察 采用原子吸收光譜法。取等濃度的UreG蛋白單體溶液和Ni2+溶液，按照2∶1混合；加入GTPγS使其終濃度為1 mmol/L ，在37 ℃水浴60 min；得到UreG聚合體(2.5 μmol/L)后，隨機分為4組。受試藥高、中、低、劑量組分別加入20、10、5 mg/L的廣藿香醇，對照組加入等體積的DMSO，使每組最終體積為1 mL；37 ℃水浴60 min后，轉(zhuǎn)移至透析袋中；再置于加入100 mL蒸餾水的燒杯中，在預(yù)冷的搖床中(4 ℃，100 r/min)搖動2 h；隨后更換滲出液，重復(fù)上述步驟繼續(xù)透析2次。收集透析袋中的保留液樣品，同時使用國家標準Ni2+溶液制作標準級差溶液，每份樣品進樣量為10 μL 。在測定波長232 nm、燈電流12 mA、光譜通帶寬度0.2 nm 的原子吸收光譜條件下，使用石墨爐法制作鎳離子標準工作曲線并檢測樣品中Ni2+濃度。Ni2+濃度越高，表明UreG結(jié)合Ni2+能力越差。

2 結(jié)果

2.1 廣藿香醇對Hp酸抵抗能力的影響 見表1。

表1 廣藿香醇對Hp酸抵抗能力的影響

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與受試藥低劑量組比較,bP<0.01；與受試藥中劑量組比較，cP<0.01。

2.2 廣藿香醇對Hp中Ure成熟過程的影響 Ure活性受試藥高、中、低劑量組和對照組分別為54.89%±11.47%、63.99%±9.46%、83.88%±11.81%、101.53%±2.55%，受試藥高、中劑量組<受試藥低劑量組<對照組(P均<0.01)。

2.3 廣藿香醇對UreG結(jié)合Ni2+濃度的影響 Ni2+濃度受試藥高、中、低劑量組和對照組分別為(0.77±0.24)、(0.80±0.22)、(1.12±0.35)、(1.56±0.42)μmol/L，受試藥高、中劑量組<受試藥低劑量組<對照組(P均<0.01)。

3 討論

目前，酶已成為藥物研發(fā)的重要作用靶點，特別是酶抑制劑，高度親和力與特異性酶抑制劑可使藥物具有更專一的治療價值[11]。研究[12]證實，廣藿香醇具有較高的安全性。研究其作用機制不僅為研發(fā)抗Hp感染的中藥先導(dǎo)化合物奠定藥理學(xué)基礎(chǔ)，同時也為治療相關(guān)疾病開辟新的途徑。

Hp能抵抗酸性環(huán)境是定植的關(guān)鍵，其中Ure是細菌擁有酸抵抗能力的最重要因素[13]。Hp的Ure屬于金屬酶，其活性依賴于金屬活性中心。Ure成熟過程從細菌胞膜上NixA蛋白轉(zhuǎn)運Ni2+開始，在細菌胞質(zhì)中Ni2+誘導(dǎo)兩個單體UreG蛋白在含有GTP的條件下形成二聚體，并填充在二聚體表面形成結(jié)合位點；二聚體會攜帶Ni2+與UreA和UreB蛋白形成Ure復(fù)合前體活性中心部位發(fā)生結(jié)合，傳遞Ni2+進入活性位點是Ure成熟的必要條件[14]。因此，不論是抑制UreA和UreB成熟或UreG與Ni2+結(jié)合的過程，均可阻斷Ure成熟過程，從而降低Hp酸抵抗能力，是清除Hp體內(nèi)定植的作用靶點之一。

本課題組前期研究已證實，廣藿香醇對體內(nèi)外的Ure活性均有良好抑制作用[15,16]。但是，對于廣藿香醇是否具有阻斷Ure傳遞及Ure成熟的過程仍然未知。本研究證實，在中性條件下，廣藿香醇各劑量組均對Hp生存無明顯影響；而在酸性沖擊條件下，廣藿香醇各劑量組均表現(xiàn)出了強大的殺菌能力，說明藥物可能抑制了Ure的活性使Hp喪失對酸性環(huán)境的耐受力從而降低其生存活性。在進一步的研究中，為了探討阻斷Ni2+傳遞途徑及Ure成熟過程是否是藥物發(fā)揮作用的機制，實驗使用大腸桿菌系統(tǒng)表達并提純了Ure蛋白，使用特定的蛋白模擬Ure的成熟途徑，避免其他因素的干擾。首先，在體外模擬了UreA和UreB構(gòu)成的Ure前體成熟過程，通過檢測Ure活性證實了廣藿香醇具有阻斷Ure成熟過程的作用。然后模擬了UreG單體蛋白與Ni2+結(jié)合形成攜帶Ni2+的UreG二聚體過程，操作中使用GTPγS替代GTP可以延緩UreG二聚體自身的水解過程；通過檢測未解離的Ni2+含量，證實了廣藿香醇具有抑制UreG二聚體攜帶Ni2+的能力。因此，廣藿香醇可降低Hp酸抵抗能力，其機制與阻斷細菌體內(nèi)Ni2+的傳遞途徑和Ure的成熟過程有關(guān)。實驗中廣藿香醇高劑量相比中劑量表現(xiàn)出對Hp酸抵抗能力更強的抑制效果，但并未體現(xiàn)出更加明顯阻斷Ni2+作用，這可能與廣藿香醇抑制Ure其他相關(guān)輔酶蛋白的表達有關(guān)，進而抑制Ure的成熟或底物尿素的傳遞，這部分設(shè)想有待下一步的實驗探討。

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Effect of patchouli alcohol on acid resistance of Helicobacter pylori

LIANDawei,XUYifei,FULijun,RENWenkang,WEIWenhui,ZHUANGHuiling,

HUANGPing,CAOHongying(GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

ObjectiveTo investigate the effect of patchouli alcohol on acid resistance of Helicobater pylori (Hp) and its mechanism.MethodsAfter Hp were cultured in vitro and identified, Hp were divided into 5 groups. The high-, medium-, and low-dose drug groups were added with 20, 10, and 5 mg/L patchouli alcohol; the positive control group was added with urea enzyme inhibitor AHA; the blank control group was added with the same amount of DMSO. Agar dilution method was used to detect the bacterial survival rates in the acidic (pH=1.0) and neutral (pH=7.0) conditions after 0.5 hour. We obtained the Hp urease protein A (UreA) , urease protein B (UreB), and urease protein G (UreG) by E.coli expression system, and mixed up UreA and UreB protein. Then, we took the UreA/UreB protein mixed solution to simulate the Ure maturation process and mixed the UreG protein monomer solution with the nickel ion (Ni2+) solution. The Ure activity was detected by Berthelot method to determine the Ure maturity. The concentration of Ni2+was measured by atomic absorption spectrometry to determine the ability of UreG carrying Ni2+.ResultsIn the neutral condition, there was no significant difference in the Hp colony forming units among the high-, medium-, and low-dose drug groups, positive control group, and blank control group. Compared with the blank control group, the Hp colony forming units of the high-, medium-, and low-dose drug groups and positive control group decreased in neutral conditions (allP<0.05), and the order was as follows: the high-dose drug group, positive control group < medium-dose drug group < low-dose drug group (allP<0.01). The urease activities of the high-, medium-, low-dose drug groups and the control group were 54.89%±11.47%, 63.99%±9.46%, 83.88%±11.81%, and 101.53%±2.55%; the concentrations of Ni2+were (0.77±0.24), (0.80±0.22), (1.12±0.35), (1.56±0.42) μmol/L, and the order was as follows: the high-dose drug group, medium-dose drug group < low-dose drug group < control group (allP<0.01).ConclusionsPatchouli alcohol can decrease the acid resistance of Hp, which may be associated with blocking the transmission pathway of Ni2+and Ure's maturation process and thus inhibiting Ure activity.

Helicobacter pylori; acid resistance; patchouli alcohol; urease mature; nickel ion transfer

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.005

R975;R573

A

1002-266X(2017)34-0014-04

2017-06-10)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81374043)；廣東省科技計劃資助項目(2016A020217019)；廣東省廣州市科技計劃資助項目(201607010336)。

連大衛(wèi)(1988-)，男，博士研究生，主要研究方向為中藥復(fù)方藥理。E-mail： 675836257@qq.com

操紅纓(1974-)，女，教授，主要研究方向為中藥復(fù)方藥理。E-mail： 1171629708@qq.com