血清白介素-27水平與視神經(jīng)脊髓炎患者疾病嚴重程度的關系☆

賈昆 劉小姣 周冰潔 張大啟 楊麗

血清白介素-27水平與視神經(jīng)脊髓炎患者疾病嚴重程度的關系☆

賈昆△劉小姣*周冰潔*張大啟*楊麗○☆

目的檢測視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica,NMO）患者與健康人血清中白介素27（interleukin-27,IL-27）水平，探討其在NMO發(fā)病中的意義及其與疾病嚴重程度的相關性。方法采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測39例NMO急性期患者與39例健康志愿者血清中IL-27水平，比較組間差異及分析NMO組血清IL-27水平與擴展殘疾狀況評分（expanded disability status scale,EDSS）、脊髓受累節(jié)段數(shù)、年復發(fā)率及水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP-4）抗體滴度等臨床指標的相關性。結果NMO組血清IL-27水平較健康對照組（healthy controls,HCs）明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），且NMO組患者血清IL-27水平與EDSS評分、脊髓受累節(jié)段數(shù)、隨訪2年平均復發(fā)率呈負相關（r=-0.439,P=0.010;r=-0.434,P=0.006;r=-0.451,P=0.031），而與AQP-4抗體滴度不存在相關性（r=-0.027,P=0.871）。多元回歸分析顯示血清IL-27水平與EDSS評分存在負相關性（B=-0.025，P=0.023）。結論IL-27可能參與了NMO的發(fā)病過程，且與疾病嚴重程度負相關，同時對于疾病的預后具有一定影響。

視神經(jīng)脊髓炎 白介素-27酶聯(lián)免疫吸附法 水通道蛋白-4抗體

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica,NMO）是一種罕見的、易發(fā)于中青年女性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）自身免疫性星形膠質(zhì)細胞病，目前認為，包括B、T細胞在內(nèi)的多種炎性細胞和細胞因子在其發(fā)病過程中扮演著重要角色[1]。IL-27是于2002年發(fā)現(xiàn)的IL-12家族的新型異源二聚體細胞因子，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮不同作用[2-3]。本課題組既往對于IL-27在視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病 （neuromyelitis optica spectrum disorder,NMOSD）中的作用進行了回顧性研究，發(fā)現(xiàn)IL-27可能參與了NMOSD的病理過程[4]。本研究以經(jīng)典NMO患者為研究對象，探討IL-27在NMO患者外周血清中的表達水平及其與臨床指標間的關系，隨訪患者，觀察IL-27是否可作為疾病復發(fā)的預后參考指標。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2010年7月~2015年7月住院治療的39例NMO患者。入組標準：符合WINGERCHUCK等[5]于2006年修訂的視神經(jīng)脊髓炎診斷標準：兩項必要標準：①視神經(jīng)炎；②脊髓炎；至少具備以下3項支持標準中的2項：①MRI脊髓病變范圍至少3個或3個以上；②MRI表現(xiàn)不符合MS表現(xiàn)；③AQP-4抗體血清學陽性。排除標準：①無CNS完整影像學資料；②存在結節(jié)病、血管炎、白塞氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等其他可造成非特發(fā)性CNS炎性脫髓鞘的系統(tǒng)免疫性疾??；③存在眼底動脈閉塞、脊髓動靜脈畸形、脊髓腫瘤等其他可能導致NMO類似癥狀的疾??；④存在身體其他系統(tǒng)嚴重的器質(zhì)性疾病或依從性較差。對照組血標本來自我院體檢中心39名健康人。所有血標本采集前6個月患者未接受過大劑量激素沖擊及其他免疫抑制劑治療。本研究得到天津醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準，取得了全體受試對象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 記錄所有研究對象性別、年齡、服藥史及留取標本時NMO患者EDSS評分、新發(fā)脊髓受累節(jié)段數(shù)，隨訪患者，記錄標本留取后2年疾病復發(fā)情況，其中EDSS評分由兩位具備資格的神經(jīng)科醫(yī)生獨立完成并校對，所有臨床信息均獲自我院臨床數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 標本采集及血清IL-27水平檢測 清晨抽取空腹靜脈血約3 mL，離心分離血清并于-80℃低溫保存，所有標本同一時間檢測。采用人IL-27 ELISA(eBioscience,San Diego,CA,USA)試劑盒檢測血清IL-27水平，應用酶標儀在450 nm波長下測定各底物吸光度值，制作標準曲線，計算各樣本IL-27濃度，最低檢測標準為9.5 pg/mL，低于此標準視為血清中IL-27水平為0 pg/mL。

1.2.3 血清AQP-4抗體水平檢測 利用轉染人AQP4質(zhì)粒的HEK293細胞通過熒光免疫沉淀法（fluoroimmunpprecipitation assay,FIPA）測定血清AQP-4抗體水平，以FU值在健康對照組均值+3倍標準差以上為陽性判斷標準[6]。

1.3 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計分析及作圖采用SPSS 20.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)和 GraphPad PRISM 5.0軟件 (Graph Pad Software Inc.,San Diego,CA,USA)完成。計量資料采用±s表示，Mann-Whitney秩和檢驗用于比較兩組間IL-27水平的差異，Spearman等級相關分析用于分析IL-27水平與臨床指標間的相關性，多元回歸分析用于檢驗各因素對患者EDSS評分的影響。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 基本資料39例急性期NMO患者包括男6例，女 33 例，年齡 21~77 歲，平均（49.26±12.86）歲，其中9例為首次發(fā)作，其余均為2次以上發(fā)作，平均EDSS評分為4.94±2.01，AQP-4抗體陽性率為82.05%（32/39）。39例患者中有23例在標本采集后進行了至少2年的隨訪。HCs組中男8例，女 31 例，年齡 21～67 歲，平均（45.13±10.97）歲，且所有人均無感染、過敏及其他自身免疫性疾病。NMO組與HCs組年齡與性別差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 NMO患者血清IL-27水平NMO組及HCs組血清IL-27水平分別為 （41.78±30.49）pg/mL、（71.08±31.53）pg/mL，二者差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（圖 1）。

圖1 NMO患者與HCs血清IL-27水平

表1 NMO患者EDSS評分多因素回歸分析

圖2 NMO患者血清IL-27水平與臨床特征的相關性

2.3 血清IL-27水平與疾病嚴重程度的關系

通過比較NMO患者血清IL-27水平與臨床資料及AQP-4抗體滴度的相關性發(fā)現(xiàn)，NMO患者血清IL-27水平與EDSS評分及脊髓受累節(jié)段數(shù)呈負相關 （r=-0.439,P=0.010;r=-0.434,P=0.006）（圖 2A、B），同時與標本采集后 2年的平均年復發(fā)率呈負相關（r=-0.451,P=0.031）（圖 2C），而與NMO患者與AQP-4抗體滴度無明顯相關性（r=-0.027,P=0.871）（圖 2D）多元回歸分析顯示血清IL-27水平與患者EDSS評分存在負相關性（B=-0.025，P=0.023），而患者年齡、性別、脊髓受累節(jié)段數(shù)及抗體滴度等未發(fā)現(xiàn)與EDSS評分存在相關性（表 1）。

3 討論

NMO是T細胞依賴的、抗體介導的、多種免疫因子參與的自身免疫性炎性疾病，典型病灶表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細胞AQP4的缺失，同時伴有大量的補體激活，從而引起免疫損傷，其發(fā)病機制復雜，至今尚不明確。IL-27是IL-12家族成員之一，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮著促進和抑制炎癥反應的雙重作用，而其在NMO中的作用目前鮮有報道。

我們研究發(fā)現(xiàn)，NMO患者血清中IL-27水平顯著低于HCs組，血清IL-27水平與EDSS評分、脊髓受累節(jié)段數(shù)存在負相關性，提示其可能在NMO病理過程中發(fā)揮抑制炎癥反應的保護性作用。這與我們既往關于IL-27與NMOSD關系的研究結果相一致[4]。YOSHIMOTO等[7]曾用不同水平的IL-27刺激小鼠脾臟B淋巴細胞并采用PCR分析結果，發(fā)現(xiàn)B細胞在IL-27的刺激下可表達T-bet mRNA，且表達水平與IL-27刺激濃度呈正相關，而T-bet又可反作用于B細胞，對其抗體類別轉換具有十分重要的作用[8-9]。除此之外，IL-27還可能通過誘導Tr1細胞的分化，促進IL-10的分泌，進而起到抑制免疫炎癥反應的作用[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)，相比于MS患者和健康人，急性期NMO患者外周血中Th17細胞的比例及其分泌產(chǎn)物IL-17的水平顯著升高[11]。高水平的Th17及記憶性Th17細胞與NMO患者疾病殘疾程度即EDSS評分相關[12]。而IL-27可通過降低視黃酸相關孤兒受體 （retinoic acid-related orphan receptor,ROR）的表達進而抑制初始Th細胞分化為Th17細胞[13]。此外，IL-27還可抑制Th17細胞分泌IL-17，從而減輕炎癥反應[14]。

除此之外，在對于患者進行隨訪后發(fā)現(xiàn)，患者血清IL-27水平與標本留取后2年的平均年復發(fā)率存在負相關性，提示IL-27可能可以作為預估NMO疾病復發(fā)的參考指標，而IL-27在疾病緩解期的滴度變化及與NMO炎癥反應的關系需要進一步觀察。本研究發(fā)現(xiàn)IL-27與AQP-4抗體水平存在相關性趨勢，但無統(tǒng)計學意義，作為NMO疾病重要生物標記物的AQP-4抗體發(fā)揮著主要免疫損傷作用，其與IL-27的關系仍需進一步大樣本研究。

總之，本文研究結果提示NMO作為抗體介導的自身免疫性疾病，細胞因子也在很大程度上影響著疾病的發(fā)展及轉歸。因此，探討IL-27與NMO之間的關系，有助于進一步認識NMO的發(fā)病機制及判斷疾病的嚴重程度，同時對疾病的預后具有一定的指導意義。此外，利用其免疫調(diào)節(jié)功能使之有可能成為治療的潛在靶點。本研究是在小樣本的基礎上的研究，雖然得到一些有意義的結果，但仍需進一步擴大樣本量進行實驗驗證。

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（責任編輯：李立）

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The study on the association of serum interleukin-27 levels with disease severity in neuromyelitis optica.

JIA Kun,LIU Xiaojiao,ZHOU Bingjie,ZHANG Daqi,YANG Li.Department of Neurology and Tianjin Neurological Institute,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China.Tel:022-60814536

ObjectiveTo examine the interleukin-27 (IL-27)levels in the serum of the patients with neuromyelitis optica(NMO)and healthy controls(HCs)and explore the correlation of the serum IL-27 level with disease severity.MethodsSerum concentrations of IL-27 from 39 patients with NMO and 39 HCs were measured by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Mann-Whitney U test was performed to analyze the difference in the IL-27 levels between the NMO group and the HCs.Spearman's rank correlation analysis was used to analyze the correlations of serum IL-27 levels with clinical parameters(EDSS,spinal cord lesion length,annual relapse rate and antibody titers of AQP-4)of NMO.ResultsThe serum IL-27 levels were significantly lower in NMO group than in HCs(P＜0.001).Serum IL-27 levels were negatively correlated with EDSS,total length of spinal cord lesion identified by MRI at the sampling,and the average relapse rate during two-year follow-up (r=-0.439,P=0.010;r=-0.434,P=0.006;r=-0.451,P=0.031).There was no significant correlation between IL-27 levels and antibody titers of AQP-4(r=-0.027,P=0.871).Multivariate regression analysis showed that serum IL-27 levels were negatively correlated with EDSS （B=-0.025，P=0.023）.ConclusionIL-27 may participate in the pathogenic process of NMO and might be a prognosis marker of the disease.

Neuromyelitis optica Interleukin-27 Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA)Aquaporine 4 antibody

R744.5+2

A

2016-06-03）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.08.007

☆國家自然科學基金面上項目（編號：81471221）;天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（重點項目）（編號：15JCZDJC35700）

* 天津市環(huán)湖醫(yī)院（天津300350）

△天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津市神經(jīng)病學研究所

○☆通信作者（E-mail：yangli2001@tmu.edu.cn）