杜美琳 申明惠 彭揚(yáng) 姜洪芳 王超 何平

雷帕霉素對(duì)肺癌LK2細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響

杜美琳 申明惠 彭揚(yáng) 姜洪芳 王超 何平

目的研究藥物雷帕霉素作用于非小細(xì)胞肺癌LK2細(xì)胞后microRNA表達(dá)的變化。方法培養(yǎng)肺癌LK2細(xì)胞，研究藥物雷帕霉素作用于非小細(xì)胞肺癌LK2細(xì)胞后microRNA表達(dá)的變化。方法培養(yǎng)肺癌LK2細(xì)胞，檢測(cè)雷帕霉素作用于LK2細(xì)胞后其中microRNA的表達(dá)變化，并對(duì)表達(dá)有顯著差異改變的microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果與對(duì)照組相比，雷帕霉素作用于LK2細(xì)胞后，9個(gè)microRNAs表達(dá)具有高顯著差異，其中miR-320c，miR-1283，miR-29b-3p等6個(gè)miRNAs表達(dá)顯著增強(qiáng)。而miR-320b，miR-19b-3p，miR-181c-6p表達(dá)明顯降低。結(jié)論雷帕霉素作用于肺癌LK2細(xì)胞后，可誘導(dǎo)多個(gè)microRNA的表達(dá)改變，可以加強(qiáng)部分microRNAs表達(dá)、也可降低多個(gè)microRNAs的表達(dá)。

雷帕霉素；肺癌；microRNA

現(xiàn)今，隨著人口老齡化，癌癥的發(fā)病率亦升高，其中肺癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一[1]。雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）最先是作為一種免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用，近年來發(fā)現(xiàn)其可以對(duì)包括肺癌的多種腫瘤細(xì)胞起抑制作用[2-3]。微小RNA（microRNA，miRNA）為內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，可作為癌基因或抑癌基因控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展。目前，對(duì)于帕霉素作用機(jī)制與非編碼miRNA的相關(guān)研究報(bào)道較少，而研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物能夠改變腫瘤細(xì)胞中部分miRNA的表達(dá)[4]，提示這些藥物可能是通過調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮抑制腫瘤作用。為抗腫瘤機(jī)理研究提供了新的研究方向。本實(shí)驗(yàn)擬通過Illumina HiSeqTM 2500 miRNA測(cè)序，對(duì)比雷帕霉素作用于肺癌LK2細(xì)胞后miRNA的表達(dá)變化，并預(yù)測(cè)miRNA靶基因，篩選其中的增殖凋亡相關(guān)基因。在miRNA水平研究雷帕霉素對(duì)LK2細(xì)胞的可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibeo公司。胎牛血清購(gòu)自天津索萊寶生物工程有限公司。0.25%胰蛋白酶購(gòu)自以色列Biological Industries公司。Trizol購(gòu)自大連寶生物工程公司。雷帕霉素購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司。離心機(jī)型：Eppendorf型，德國(guó)。二氧化碳培養(yǎng)箱：HERA cell 150型，德國(guó)。細(xì)胞系：人肺癌LK2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 首先在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在飽和濕度、5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺癌LK2細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LK2細(xì)胞，接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中過夜，加入濃度為1 μmol/L的雷帕霉素，并采用等量培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，繼續(xù)于37℃、5%二氧化碳的飽和濕度溫箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 檢測(cè)篩選miRNA PBS洗2遍，每個(gè)培養(yǎng)瓶加入1 ml Trizol，使其充分接觸細(xì)胞，待細(xì)胞懸浮，用去RNA酶處理的槍頭吹打混勻，吸入經(jīng)去RNA酶處理過的EP管中，提取的總RNA于-80℃保存。提取的總RNA（空白對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組）于干冰中郵寄到廣州銳博公司，通過Illumina HiSeqTM 2500測(cè)序雷帕霉素作用后肺癌LK2細(xì)胞中miRNA的表達(dá)變化。測(cè)序過程：（1）制備cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。（2）測(cè)序所得到序列（Reads）集，去掉序列兩端接頭、去掉低質(zhì)量序列進(jìn)行最初的數(shù)據(jù)初步過濾，進(jìn)而得到干凈序列，對(duì)其進(jìn)行序列的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)以及樣本間公共序列統(tǒng)計(jì)。對(duì)miRNA的差異表達(dá)篩選。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

測(cè)序篩選雷帕霉素作用LK2細(xì)胞后miRNA的表達(dá)變化。9個(gè)miRNA表達(dá)顯著差異，miR-320c，miR-1283，miR-29b-3p，miR-181c-5p，miR-24-3p，miR-26a-5p表達(dá)顯著增強(qiáng)。miR-320b，miR-19b-3p，miR-181c-6p表達(dá)顯著降低。同時(shí)還有6個(gè)表現(xiàn)出差異的miRNA（表1）。

3 討論

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種真核生物內(nèi)源性非編碼的小分子單鏈RNA。miRNA長(zhǎng)度約18～25個(gè)核苷酸。miRNAs通過形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體與靶基因3’端的非翻譯區(qū)非完全互補(bǔ)配對(duì)相結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解，抑制靶向基因的表達(dá)[5]，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、凋亡[6]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在肺癌組織或肺癌細(xì)胞系中表達(dá)異常[7]。雖然目前對(duì)miRNA的研究尚不明確，但已有實(shí)驗(yàn)可證明miRNA表達(dá)與人類肺癌有相關(guān)性，且具較高的特異性，比如miR-155、miR-145、miR-34、miR-202等在肺癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞表達(dá)異常[7-9]，提示miRNA可能是抗癌藥物潛在的作用靶點(diǎn)。雷帕霉素是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin，mTOR）的抑制劑，通過與mTOR結(jié)合可影響多種腫瘤細(xì)胞的體外增殖和生長(zhǎng)周期[10-11]，mTOR信號(hào)通路的異常激活，可以調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)，且有證據(jù)顯示mTOR抑制劑的抗腫瘤作用可以產(chǎn)生延長(zhǎng)穩(wěn)定期或緩解病情的作用[12]。這些將推動(dòng)雷帕霉素的進(jìn)一步研究。雖然已有研究表明雷帕霉素具有抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的作用，且其抗癌的復(fù)雜作用機(jī)制仍然是目前的研究熱點(diǎn)，但現(xiàn)研究多為聯(lián)合藥物觀察臨床療效或側(cè)重于觀察調(diào)控編碼蛋白基因表達(dá)，而對(duì)非編碼miRNA分子與雷帕霉素治療研究的報(bào)道研究較少。miRNA通過影響RNA對(duì)基因表達(dá)翻譯起作用，在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)中起到樞紐作用，因此miRNA在腫瘤治療中可能成為藥物的作用靶點(diǎn)，提示作用靶點(diǎn)既包括編碼蛋白的相關(guān)基因，還可包括非編碼區(qū)的miRNA，為開發(fā)抗腫瘤藥物提供了新的方向。

表1 LK2細(xì)胞應(yīng)用雷帕霉素的miRNA 表達(dá)成倍比例改變

本實(shí)驗(yàn)通過篩選雷帕霉素作用于LK2細(xì)胞后miRNA的表達(dá)變化，觀察到9個(gè)miRNA表達(dá)顯著差異，其中miR-320c、miR-1283、miR-29b-3p、miR-181c-5p、miR-24-3p、miR-26a-5p表達(dá)顯著增強(qiáng)。miR-320b、miR-19b-3p、miR-181c-6p表達(dá)顯著降低。通過預(yù)測(cè)有顯著差異的miRNA相關(guān)靶基因，為雷帕霉素對(duì)LK2細(xì)胞的增殖及凋亡的影響研究提供了依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷帕霉素作用LK2細(xì)胞后可調(diào)控誘導(dǎo)多個(gè)miRNAs表達(dá)改變。本實(shí)驗(yàn)初步篩選了miRNA在雷帕霉素作用于肺磷癌系LK2細(xì)胞后miRNA的改變，為治療腫瘤的機(jī)理研究提供了新的研究思路和理論依據(jù)。

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The Effect of Rapamycin on microRNA Expression of Lung Cancer LK2 Cell

DU Meilin SHEN Minghui PENG Yang JIANG Hongfang WANG Chao HE Ping Department of Geriatrics, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang Liaoning 110004, China

ObjectiveTo study the effects of rapamycin on microRNA expression of lung cancer LK2 cell in vitro culture.MethodsIt was objective to culture lung cancer LK2 cells and to study the changes of microRNA expression after rapamycin treatment in non-small cell lung cancer LK2 cells, target genes were predicted for microRNA with significant differences in expression.ResultsThe treatment of cells with rapamycin could affect the expression of microRNAs. Using Illumina HiSeqTM 2500 miRNA Sequencing analysis, 9 microRNAs were found with high expression changes in rapamycin -treated LK2 cells. In these miRNAs, miR-320c, miR-1283, miR-29b-3p express higher. miR-320b,miR-19b-3p, miR-181c-6p express lower.ConclusionAfter rapamycin act in lung cancer LK2 cells, it can induce multiple microRNA expression changes, such as enhance and reduce the expression of some microRNAs.

rapamycin; lung cancer; microRNA

R734

A

作者單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，遼寧 沈陽 110004

1674-9308（2017）21-0150-03

遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（2013225021）

基金項(xiàng)目：盛京自由研究者計(jì)劃（201205）

何平

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．21．079