馬瑞陽，閆聰聰，符博敏，俞花美，葛成軍,2,*

1. 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?5702282. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058

生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子萌發(fā)的影響

馬瑞陽1，閆聰聰1，符博敏1，俞花美1，葛成軍1,2,*

1. 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 5702282. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058

采用土培模擬污染實(shí)驗，將甘蔗渣炭、菠蘿渣炭和木薯渣炭分別以0%、0.1%、0.5%和1.0%的炭土比添加到磚紅壤中，研究土霉素脅迫下小白菜種子萌發(fā)效應(yīng)。結(jié)果表明：(1)生物質(zhì)炭促進(jìn)種子萌發(fā)；土霉素在0～300 mg·kg-1脅迫下種子發(fā)芽率未受明顯影響，300～500 mg·kg-1時受輕微抑制。(2)土霉素為0～100 mg·kg-1時對種子根及芽伸長呈促進(jìn)作用，促進(jìn)率最高達(dá)33.05%。100～500 mg·kg-1呈抑制效應(yīng)，最大抑制率63.98%；種子對土霉素的敏感順序依次為：根伸長>芽伸長>發(fā)芽率。(3)在土霉素脅迫下炭土比與種子根伸長呈顯著正相關(guān)。3種生物質(zhì)炭對小白菜種子根及芽伸長的促進(jìn)效果呈：木薯渣炭>菠蘿渣炭>甘蔗渣炭。(4)生物質(zhì)炭和低濃度土霉素共同促進(jìn)小白菜萌發(fā)，對高濃度土霉素毒性有緩解作用。

生物質(zhì)炭；土霉素脅迫；小白菜；根伸長；芽伸長

Received15 January 2017accepted20 March 2017

Abstract: To explore the effects of oxytetracycline on the germination of cabbage seeds, soil culture experiment was used in the laterite soil in this study, with the supplement of bagasse biochar, pineapple biochar and cassava biochar at a carbon/soil ratio of 0, 0.1%, 0.5% and 1%, respectively. The results showed that: (1) Oxytetracycline had little effect on the germination rate of cabbage seeds at low concentration (i.e., 0-300 mg·kg-1), while inhibited it lightly at higher concentrations (i.e., 300-500 mg·kg-1); (2) Low concentrations of oxytetracycline (i.e., 0-100 mg·kg-1) promoted the root/shoot elongation of cabbage seeds with the maximum promotion rate of 33.05%. However, high concentrations (i.e., 100-500 mg·kg-1) of oxytetracycline had inhibitory effects on them and the inhibition rate raised up to 63.98%. On the other hand, seeds were sensitive to oxytetracycline, but the root elongation was more sensitive than shoot elongation and than germination rate; (3) Positive correlations between the ratio of biochar/soil and the root elongation of cabbage seed were also observed under oxytetracycline stress. All three types of biochars promoted the elongation, with more obvious promotion effect induced by cassava biochar than that of pineapple biochar, and than bagasse biochar;(4) Biochars combined with low concentrations of oxytetracycline jointly promoted the root and shoot elongation, and meanwhile alleviated the toxicity at high concentrations of oxytetracycline.

Keywords: biochar; oxytetracycline stress; cabbage; root elongation; shoot elongation

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，抗生素的應(yīng)用范圍和施用總量持續(xù)增長。據(jù)統(tǒng)計，歐共體抗生素的消耗量每年達(dá)5 000 t[1]。2000年我國獸藥抗生素用量已經(jīng)超過6 000 t[2]。研究表明，施用到動物體內(nèi)的抗生素有25%～75%以原藥形式通過糞便排出體外[3-5]，并且在土壤中長期持留[6-7]。土霉素是我國使用量最多的獸藥抗生素之一，其在動物體內(nèi)消除緩慢、代謝率低，多數(shù)以原藥形式通過新陳代謝排出并進(jìn)入土壤環(huán)境[8-9]。進(jìn)入土壤中的土霉素，由于存在外源不斷輸入，導(dǎo)致長期積累于土壤中。土霉素極易在植物體內(nèi)富集，可通過食物鏈對人體產(chǎn)生危害[10-11]。

生物質(zhì)炭是由生物質(zhì)在限氧條件下熱解制備的富碳材料[12]。多孔、高比表面積、含氧活性基團(tuán)等特性賦予其良好的吸附能力[13]。作為土壤腐殖質(zhì)中高度芳香化結(jié)構(gòu)組分的重要來源，生物質(zhì)炭在穩(wěn)定土壤有機(jī)碳庫、持留土壤養(yǎng)分、維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡也發(fā)揮著重要作用[14]。生物質(zhì)炭具有成本低、綠色環(huán)保、技術(shù)簡單、治污效率高等優(yōu)點(diǎn)，在污水處理和土壤重金屬鈍化等方面應(yīng)用廣泛，但其在土壤抗生素污染修復(fù)中的應(yīng)用較少。

本文選取小白菜為供試作物，通過土培模擬污染實(shí)驗研究了外源生物質(zhì)炭施入土壤后不同濃度土霉素對小白菜種子萌發(fā)的影響，并對比不同原料制備的生物質(zhì)炭對土霉素毒性的緩解效應(yīng)，旨在揭示生物質(zhì)炭農(nóng)用的環(huán)境效應(yīng)及其在抗生素污染土壤修復(fù)中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試作物小白菜(Brassica rapa var. glabra)，品種為揭農(nóng)三號甜白菜，產(chǎn)地為廣東省揭陽市，培育單位為保豐種子商行。購自海南省?？谑胁藵M堂種子經(jīng)銷部。

供試土壤為磚紅壤，采自海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院基地?zé)o污染源農(nóng)田表層(0～20 cm)土壤，自然風(fēng)干后磨碎并過2 mm尼龍篩備用。實(shí)驗土壤基本理化性質(zhì)如下：pH值為5.31，全氮、全磷、全鉀和有機(jī)質(zhì)含量分別為4.21%、0.15%、0.76%和2.98%。

供試抗生素為土霉素，純度98%，購自adamas-beta公司。

分別將木薯渣、甘蔗渣和菠蘿皮渣經(jīng)自然風(fēng)干，碾碎后置于馬弗爐中，在限氧條件下200 ℃預(yù)炭化2 h后，將溫度升至550 ℃并保持炭化3 h，制得3種不同性質(zhì)生物質(zhì)炭后過0.2 mm篩備用。

本實(shí)驗在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院環(huán)境功能材料實(shí)驗室內(nèi)完成。發(fā)芽率實(shí)驗在受控智能人工氣候培養(yǎng)箱(杭州錢江ZRX-300D)中進(jìn)行。試驗用水為Spring-S60i+PALL超純水系統(tǒng)制備。

1.2 實(shí)驗方法

稱取50 g風(fēng)干土壤于90 mm硬質(zhì)玻璃培養(yǎng)皿中，將生物質(zhì)炭分別以0%、0.1%、0.5%和1.0%的炭土比加入土壤中，添加土霉素濃度分別為0、10、50、100、300、500 mg·kg-1，每個處理設(shè)置3個平行，用去離子水調(diào)節(jié)土壤至最大持水量的60%左右，用醫(yī)用鑷子將植物種子均勻播種于土壤中(放置種子時，保持種子胚根末端和生長方向呈直線)，每皿放置20粒種子。蓋好玻璃培養(yǎng)皿，置于人工氣候培養(yǎng)箱中25 ℃下暗處培養(yǎng)，定期觀察種子發(fā)芽數(shù)、根長、芽長等指標(biāo)。當(dāng)空白對照種子發(fā)芽率>70%，根長達(dá)到20 mm時結(jié)束實(shí)驗。

1.3 測定指標(biāo)與方法

選取發(fā)芽率、根和芽伸長及其抑制率作為測定指標(biāo)。

發(fā)芽率作為檢驗種子播種品質(zhì)的指標(biāo)可指示種子萌發(fā)能力，計算公式如下：

種子根及芽伸長用卷尺直接測量，可直觀的測定土霉素脅迫下小白菜種子的生態(tài)毒性效應(yīng)。抑制率(IR)采用如下計算公式：

抑制率(IR)=

以濃度-抑制率繪制曲線，進(jìn)行回歸分析，并根據(jù)回歸方程計算出種子生長抑制率為50%時土霉素的濃度(IC50)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0和Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和對濃度-抑制率曲線進(jìn)行擬合并作圖。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子發(fā)芽率的影響

生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子發(fā)芽率的影響如圖1所示。由圖1(a)可知，甘蔗渣炭炭土比為1.0% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，小白菜種子發(fā)芽率增大。土霉素濃度小于300 mg·kg-1時對種子萌發(fā)影響較小。種子發(fā)芽率在70%左右波動，這可能與種皮對有機(jī)污染物透過具有一定的阻礙作用有關(guān)，也可能與種子萌發(fā)過程能量主要來源于相關(guān)酶對種子內(nèi)淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的活化分解作用有關(guān)[15]。濃度為500 mg·kg-1時，發(fā)芽率略有下降。由圖1(b)可知，木薯渣炭存在時土霉素脅迫下種子發(fā)芽率介于65%～95%，對小白菜發(fā)芽率有一定促進(jìn)作用且炭土比為1.0%時效果最好。這可能是生物質(zhì)炭增加土壤肥力，改善土壤環(huán)境促進(jìn)小白菜種子萌發(fā)。同甘蔗渣炭一樣，除炭土比為1.0%外小白菜種子發(fā)芽率受土霉素的影響較小，當(dāng)土霉素濃度高達(dá)500 mg·kg-1時，炭土比為0%和0.1%條件下的種子發(fā)芽率明顯減小。由圖1(c)可知，菠蘿渣炭促進(jìn)種子萌發(fā)，當(dāng)炭土比為0.1%時促進(jìn)作用最明顯。土霉素脅迫濃度為500 mg·kg-1時，炭土比為0%和0.5%條件下的種子發(fā)芽率下降。

對比3種生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子發(fā)芽率的影響可知，生物質(zhì)炭在一定程度上促進(jìn)種子萌發(fā)。甘蔗渣炭和木薯渣炭在炭土比為1.0%時促進(jìn)效果最優(yōu)，而菠蘿渣炭在炭土比為0.1%時的促進(jìn)效果最明顯。3種生物質(zhì)炭在土霉素脅迫下對發(fā)芽率影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制，可能是土霉素毒性高，超過種子萌發(fā)耐受極限，導(dǎo)致小白菜種子發(fā)芽率降低。

2.2 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子根伸長的影響

2.2.1 生物質(zhì)炭對小白菜種子根伸長的影響

由圖2可知，在沒有土霉素脅迫條件下施加3種生物質(zhì)炭的小白菜種子根伸長值均大于未施加生物質(zhì)炭時的值，說明3種生物質(zhì)炭對根伸長均具有促進(jìn)作用。炭土比相同條件下，木薯渣炭的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于其他2種炭。3種炭的促進(jìn)效果表現(xiàn)為：木薯渣炭>菠蘿渣炭>甘蔗渣炭。土壤中炭土比越大，根伸長長度越長。

圖1 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子發(fā)芽率的影響Fig. 1 The effects of biochar on cabbage seed germination rate under oxytetracycline stress

圖2 生物質(zhì)炭對小白菜種子根伸長的影響Fig. 2 Effect of the biochar on root elongation of cabbage

圖3 土霉素脅迫對小白菜種子根伸長的抑制率Fig. 3 The inhibition of oxytetracycline on root elongation of cabbage

2.2.2 土霉素脅迫對小白菜種子根伸長的影響

由圖3可知，土霉素濃度為0～100 mg·kg-1，小白菜種子根伸長抑制率為負(fù)值，說明外源土霉素促進(jìn)種子根伸長，促進(jìn)作用先增強(qiáng)后減弱，在土霉素濃度為50 mg·kg-1時促進(jìn)作用最明顯。濃度為100～500 mg·kg-1時，種子根伸長抑制率為正值，表明種子根受土霉素脅迫抑制，抑制效應(yīng)隨土霉素濃度增大而增強(qiáng)。

在不加炭的對照土壤中，土霉素濃度和小白菜根伸長抑制率呈顯著線性相關(guān)性(P<0.05)。土霉素脅迫下種子根長的IC50值為417.87 mg·kg-1，說明供試小白菜品種優(yōu)良，對土霉素耐受性較好。

2.2.3 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子根伸長的影響

生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子根伸長的影響如圖4所示。當(dāng)土壤中土霉素濃度在0～50 mg·kg-1范圍，小白菜種子根伸長抑制率為負(fù)值且呈下降趨勢，說明低濃度土霉素和生物質(zhì)炭共同促進(jìn)小白菜根伸長，且促進(jìn)效果隨濃度的增大而增強(qiáng)。濃度為50～100 mg·kg-1，小白菜根伸長抑制率為負(fù)值并呈減弱趨勢，說明隨土霉素濃度增大促進(jìn)效果減弱。土霉素濃度為100～500 mg·kg-1時抑制小白菜根伸長，而生物質(zhì)炭具促進(jìn)作用，二者共同影響呈現(xiàn)出種子根伸長抑制率隨土霉素濃度升高而增大，且隨炭土比升高而降低的趨勢。土霉素脅迫下，與未添加生物質(zhì)炭對比，添加生物質(zhì)炭可降低抑制率。說明生物質(zhì)炭促進(jìn)種子根伸長，且對土霉素低濃度促進(jìn)效應(yīng)具有一定影響，當(dāng)炭土比1.0%時促進(jìn)效果最明顯。

圖4 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子根 伸長抑制率的影響Fig. 4 The effect of biochar on root elongation inhibition rate of oxytetracycline to cabbage

外源生物質(zhì)炭加入時，土霉素濃度和小白菜種子根伸長抑制率之間具顯著相關(guān)性(P<0.05)，回歸方程如表1所示。添加3種生物質(zhì)炭后小白菜根伸長IC50值均大于不加炭處理，說明土壤中施加生物質(zhì)炭促進(jìn)小白菜根伸長。當(dāng)炭土比分別為0.1%、0.5%和1.0%時，甘蔗渣炭添加組土霉素對小白菜根伸長的IC50值分別為483.39、511.24和552.91 mg·kg-1，木薯渣炭組分別為453.15、489.35和767.23 mg·kg-1，菠蘿渣炭組分別為469.73、465.57和548.76 mg·kg-1。小白菜根伸長的IC50值總體上隨炭土比的增大而增大，說明土壤中生物質(zhì)炭含量的增大可有效促進(jìn)小白菜根伸長。因此，土壤中施入生物質(zhì)炭可有效緩解高濃度土霉素脅迫下小白菜根伸長的毒性效應(yīng)。對比3種生物質(zhì)炭緩解毒性的效果，木薯渣炭效果最優(yōu)。

2.3 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長的影響

2.3.1 生物質(zhì)炭對小白菜種子芽伸長的影響

如圖5所示，無土霉素脅迫下，炭土比和芽伸長長度呈正相關(guān)。即炭土比越大，芽伸長長勢越好。3種生物質(zhì)炭對小白菜種子芽伸長均起促進(jìn)作用，且促進(jìn)效果與根伸長相似，均表現(xiàn)為：木薯渣炭>菠蘿渣炭>甘蔗渣炭。

2.3.2 土霉素脅迫對小白菜種子芽伸長的影響

如圖6所示，土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長抑制率的影響呈低濃度(小于100 mg·kg-1)促進(jìn)，高濃度(大于100 mg·kg-1)抑制的趨勢。土霉素脅迫下小白菜芽伸長的IC50值為523.61 mg·kg-1且大于根的IC50值，說明芽對土霉素的耐受性更強(qiáng)，根對土霉素的敏感性更大。這可能是芽伸長過程所需的物質(zhì)和能量主要來自胚內(nèi)的養(yǎng)分供應(yīng)，其受外界土壤中土霉素影響不大。而根一開始就完全暴露于土壤中，其生長發(fā)育全過程受土壤條件的影響較大。當(dāng)外源污染物存在于土壤環(huán)境中時，土壤中微生物活性受抑制，營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化受阻，進(jìn)而導(dǎo)致作物根尖細(xì)胞有絲分裂數(shù)減少，分裂速度減慢，根伸長被抑制[16]。因此，根對土壤污染的反應(yīng)更敏感和直接。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致[17-19]。

圖5 生物質(zhì)炭對小白菜種子芽伸長的影響Fig. 5 Effect of the biochar on shoot elongation of cabbage

圖6 土霉素脅迫對小白菜種子芽伸長抑制率的影響Fig. 6 The effect of oxytetracycline on shoot elongation inhibition rate of cabbage

表1 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子根伸長影響的回歸方程和IC50Table 1 Regression equation and IC50 for seed root elongation under the effect of biochar and oxytetracycline stress

注：RI為根伸長抑制率；x為土霉素的濃度。

Note: RI is the inhibition rate of root elongation; x is oxytetracycline concentration.

圖7 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子 芽伸長抑制率的影響Fig. 7 The effect of biochar on shoot elongation inhibition rate of oxytetracycline to cabbage

2.3.3 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長的影響

生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長的影響如圖7所示，其趨勢和根相一致：炭土比越大，芽伸長長勢越好。低濃度土霉素脅迫下，種子細(xì)胞分裂素分泌增多，芽伸長速度加快，生物質(zhì)炭也促進(jìn)芽伸長，二者共同作用使種子芽伸長長度增大，抑制率減?。桓邼舛韧撩顾匚廴緯r，芽伸長受土霉素抑制，生物質(zhì)炭促進(jìn)芽伸長并緩解土霉素毒性。

土壤中施入生物質(zhì)炭時，土霉素濃度與小白菜種子芽伸長抑制率之間具顯著相關(guān)性(P<0.05)，回歸方程如表2所示。在土霉素脅迫下，土壤中甘蔗渣炭除了炭土比0.1%以外，種子芽的IC50值均大于不加炭的IC50值且變化幅度較小，說明甘蔗渣炭對種子芽伸長具有輕微促進(jìn)作用。木薯渣炭也呈現(xiàn)相似趨勢，炭土比為0.1%時種子IC50值較小，炭土比為0.5%和1.0%時IC50值大幅增大，說明木薯渣炭促進(jìn)效應(yīng)明顯。土壤中添加菠蘿渣炭，種子芽伸長的IC50值隨炭土比的增大而增大且變化幅度較小。對比3種生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下種子芽伸長的影響效果，木薯渣炭效果最優(yōu)。

綜上所述：

(1) 小白菜種子萌發(fā)的發(fā)芽率受土霉素的影響較小，施加生物質(zhì)炭則可促進(jìn)種子萌發(fā)。土霉素對小白菜種子根的抑制作用較芽明顯。小白菜對土霉素的敏感順序依次為根伸長>芽伸長>發(fā)芽率，根伸長可作為反映土壤被土霉素污染狀況的敏感指標(biāo)。

(2) 小白菜根及芽伸長抑制率與土壤中土霉素濃度呈線性關(guān)系。低濃度土霉素對種子根及芽伸長起促進(jìn)作用；高濃度土霉素脅迫下，種子根及芽伸長受抑制。

(3) 3種生物質(zhì)炭對小白菜種子根及芽伸長起促進(jìn)作用。根及芽伸長促進(jìn)效果總體呈現(xiàn)：木薯渣炭>菠蘿渣炭>甘蔗渣炭。生物質(zhì)炭可緩解土霉素毒性作用。隨著炭土比的增加，小白菜種子根伸長的IC50隨之增大，芽伸長的IC50值亦總體增大。

(4) 生物質(zhì)炭和低濃度土霉素共存時可促進(jìn)小白菜根及芽伸長，但與高濃度土霉素共存時呈拮抗效應(yīng)，影響種子萌發(fā)。生物質(zhì)炭對高濃度土霉素毒性有緩解作用。

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EffectsofBiocharonSeedGerminationofCabbageundertheStressofOxytetracycline

Ma Ruiyang1, Yan Congcong1, Fu Bomin1, Yu Huamei1, Ge Chengjun1,2,*

1. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China2. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170115006

2017-01-15錄用日期2017-03-20

1673-5897(2017)3-564-08

X171.5

A

葛成軍(1977—)，男，江西南昌人，博士，教授，主要研究方向為污染物環(huán)境行為。

表2生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子芽伸長影響的回歸方程和IC50
Table 2 Regression equation and the IC50for seed shoot elongation under the effect of the biochar and oxytetracycline stress

炭土比Carbonratio擬合方程FittingequationR2PIC50/(mg·kg-1)不加炭Nobiocharadded0%SI=2E-06x2-1E-05x-0．04310．9633<0．01523．61甘蔗渣炭Bagassebiochar0．1%SI=3E-06x2-0．0003x-0．07540．9158<0．01490．790．5%SI=3E-06x2-0．0005x-0．11120．949<0．01542．331．0%SI=3E-06x2-0．0004x-0．23770．9201<0．01567．01木薯渣炭Cassavabiochar0．1%SI=3E-06x2-0．0004x-0．08870．9862<0．01514．640．5%SI=1E-06x2-0．0003x-0．22430．8768<0．051014．181．0%SI=7E-07x2+0．0001x-0．41890．8015<0．051076．53菠蘿渣炭Pineapplebiochar0．1%SI=2E-06x2-8E-06x-0．12090．876<0．05559．190．5%SI=2E-06x2+0．0003x-0．27920．9366<0．01553．671．0%SI=3E-06x2-0．0005x-0．35320．9695<0．01623．10

注：SI為芽伸長抑制率；x為土霉素的濃度。

Note: SI is shoot elongation inhibition rate; x is oxytetracycline concentration.

國家自然科學(xué)基金項目(21467008)；國家自然科學(xué)基金項目(21367011)；海南省自然科學(xué)基金項目(413123)；中西部高校提升綜合實(shí)力工作資金項目(ZXBJH-XK004, ZXBJH-XK005, MWECSP-RT08)；海南省研究生創(chuàng)新科研課題項目(Hys2016-22)

馬瑞陽(1993-)，女，碩士研究生，研究方向為污染物環(huán)境行為，E-mail: 15692557581@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: gcj3007@163.com

馬瑞陽, 閆聰聰, 符博敏, 等. 生物質(zhì)炭對土霉素脅迫下小白菜種子萌發(fā)的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(3): 564-571

Ma R Y, Yan C C, Fu B M, et al. Effects of biochar on seed germination of cabbage under the stress of oxytetracycline [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 564-571 (in Chinese)