王 舒， 韋思平， 王 力， 陳碧瓊， 張 春， 王 欽， 杜 曦*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000)

圖1 (2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of (2-pentyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate

環(huán)氧化合物是重要的藥物合成中間體，經(jīng)反應(yīng)可以得到一系列具有生物活性的藥物[1]，如以(R)-環(huán)氧氯丙烷為原料合成的(S)-美托洛爾是一種選擇性的β1受體阻滯藥[2]。某些環(huán)氧化合物本身也具有生物活性，例如，以環(huán)氧乙烷環(huán)己烯酮為骨架的α-環(huán)氧拉帕醌對(duì)亞馬遜利什曼原蟲具有抑制作用[3]。理想的藥物須具有相應(yīng)的生物活性，同時(shí)還應(yīng)有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性、選擇性和生物利用度等，因此對(duì)藥物分子進(jìn)行修飾以改善其生物特性顯得十分重要，而磷酸酯化是一種常用的重要修飾手段[4]，如惡唑烷類抗生素泰地唑利[5]，在引入磷酸酯基后，其生物利用度和酸堿穩(wěn)定性均得到提高。作者所在課題組已合成的2-戊基-3-苯基-2,3-環(huán)氧丙醇及其類似物在初步的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究中顯示出了一定的活性，為進(jìn)一步提高活性，考慮在其分子結(jié)構(gòu)中引入磷酸酯基團(tuán)以制備環(huán)氧磷酸酯類化合物，以期提高生物利用度、穩(wěn)定性以及對(duì)細(xì)胞膜的通過性，進(jìn)而產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制作用。手性前體化合物2-戊基-3-苯基-2,3-環(huán)氧丙醇進(jìn)行磷酸酯化反應(yīng)可獲得手性的環(huán)氧磷酸酯類化合物。

手性化合物的對(duì)映體往往具有不同的生理活性[6 - 8]，因此進(jìn)行手性環(huán)氧磷酸酯化產(chǎn)物對(duì)映體過量值(ee值)的測(cè)定，對(duì)磷酸酯化反應(yīng)條件的調(diào)控及產(chǎn)物純度的檢測(cè)具有非常重要的意義。目前，未見高效液相色譜法拆分(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯(圖1)對(duì)映體的相關(guān)報(bào)道。因此，本文對(duì)(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體進(jìn)行了較深入的高效液相色譜拆分研究，以期為該類化合物的手性拆分提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters1525-2487型高效液相色譜儀(美國(guó),Waters公司)；KQ5200型超聲脫氣機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

正己烷、異丙醇、乙醇(色譜純，美國(guó)Fisher試劑公司)；1,3,5-三叔丁基苯(上海阿達(dá)瑪斯公司)。(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯(西南醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)平臺(tái)提供)。

1.2 樣品制備

取3 mg (2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯，加入1.5 mL正己烷，超聲混勻后作為母液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralpak AS-H(250×4.6 mm i.d.，5 μm),流動(dòng)相：正己烷-異丙醇、正己烷-乙醇，使用前用0.45 μm濾膜過濾并超聲脫氣15 min；流速：0.6～1.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20～35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性柱的選擇

圖2 (2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯在不同手性柱上的色譜圖Fig.2 Chromatograms of (2-pentyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate on different chiralcel columns(a)Chiralcel OD-H column;(b) Chiralpak AS-H column;(c) Chiralpak AD-H column.mobile phase:n-hexance-isopropanol(90∶10,V/V;flow rate:1.0 mL/min;column temperature:25 ℃.

分別考察了Chiralcel OD-H、Chiralpak AD-H、Chiralpak AS-H三種手性色譜柱對(duì)(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體的拆分情況，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體在Chiralcel OD-H柱上不能實(shí)現(xiàn)完全分離(分離度RS<1.5)，但是在Chiralpak AD-H、AS-H柱上均可完全分離。有趣的是，我們前期對(duì)該樣品的手性前體化合物2-戊基-3-苯基-2,3-環(huán)氧丙醇進(jìn)行了拆分研究，結(jié)果顯示該手性前體化合物在Chiralcel OD-H柱上可完全分離(RS=1.626)，而在Chiralpak AD-H和AS-H柱上基本不能分離[9]。Chiralcel OD-H柱的固定相是以β-1,4糖苷鍵連接形成的纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；而Chiralpak AD-H和Chiralpak AS-H柱的固定相是以α-1,4糖苷鍵連接形成的淀粉型固定相，AD-H的衍生基團(tuán)是三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，AS-H為三(S-α-甲基苯基氨基甲酸酯)。不同的糖苷鍵連接方式導(dǎo)致所形成的固定相的空間結(jié)構(gòu)不同[10]，以直鏈淀粉為固定相的Chiralpak AD-H和AS-H柱對(duì)(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體表現(xiàn)出不錯(cuò)的拆分能力，而對(duì)其手性前體2-戊基-3-苯基-2,3-環(huán)氧丙醇則不能完全分離，可能是由于直鏈淀粉所形成的螺旋空間結(jié)構(gòu)與(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯的分子大小更匹配，導(dǎo)致該對(duì)映體與直鏈淀粉固定相之間的作用力更強(qiáng)，拆分效果更好。對(duì)于同樣以螺旋結(jié)構(gòu)的直鏈淀粉為固定相的Chiralpak AD-H和AS-H柱，由于其衍生基團(tuán)不同導(dǎo)致分離效果仍存在差異。AD-H柱的衍生基團(tuán)中，氨基氮原子直接與苯環(huán)相連，使該氮原子周圍的電子云強(qiáng)烈偏向苯環(huán)，氨基氫正電性增強(qiáng)，更易于與(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯分子中的氧原子形成氫鍵，且其苯環(huán)上連接的兩個(gè)供電子的甲基，使苯環(huán)上的電子云密度增強(qiáng)，從而π-π作用力增強(qiáng)，所以對(duì)映體在AD-H柱上的分離度高于AS-H柱，這表明AD-H柱可以有較高的載樣量。兼顧分離度和分離時(shí)間兩個(gè)因素，本實(shí)驗(yàn)采用Chiralpak AS-H柱進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了以正己烷-異丙醇、正己烷-乙醇作流動(dòng)相時(shí)，(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體在Chiralpak AS-H上的拆分情況，結(jié)果見表1?？梢钥闯觯砸掖己康扔诨蛐∮?0%的正己烷-乙醇作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)映體可完全分離(RS≥ 1.625)；以正己烷-異丙醇為流動(dòng)相時(shí)，異丙醇含量從5%增加到20%時(shí)均可實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的完全分離(RS≥ 2.968)。隨著醇含量降低，保留時(shí)間(t)、容量因子(k)和分離度(RS)均不同程度的增大?；趯?duì)保留時(shí)間、分離度及柱壓等因素的綜合考慮，選擇正己烷-異丙醇(85∶15,V/V)作為流動(dòng)相進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn)。

表1 流動(dòng)相組成對(duì)分離的影響

2.3 流速的選擇

以正己烷-異丙醇(85∶15,V/V)為流動(dòng)相，考察0.6～1.4 mL/min的流速范圍內(nèi)，手性AS-H柱對(duì)(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體的分離情況,見表2。結(jié)果表明，隨著流速的增加，保留時(shí)間(t)、理論塔板數(shù)(N)和分離度(RS)均有明顯降低，分離因子(α)基本不變。其主要原因是增加流速，樣品與固定相之間相互作用達(dá)到分配平衡的次數(shù)減少，導(dǎo)致理論塔板數(shù)和分離度降低。由于對(duì)映體在兩相中分配系數(shù)相對(duì)恒定，所以分離因子基本不變。綜合考慮分析時(shí)間和分離度，最終選擇1.0 mL/min作為拆分流速。

表2 流速對(duì)分離的影響

2.4 溫度的選擇

在已優(yōu)化的色譜條件下，考察柱溫在20～35 ℃時(shí)對(duì)(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯對(duì)映體拆分的影響，結(jié)果見表3。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，分離因子(α)基本保持不變，

表3 柱溫對(duì)分離的影響

而保留時(shí)間(t)、容量因子(k)及分離度(RS)均呈減小的趨勢(shì)，但均可實(shí)現(xiàn)完全分離。這可能是由于溫度升高，樣品與固定相之間氫鍵作用力、π-π作用力以及偶極作用力減小，導(dǎo)致保留時(shí)間、容量因子隨之減??；同時(shí)，溫度升高可能導(dǎo)致了固定相對(duì)對(duì)映體的手性識(shí)別作用力的差值減小，從而導(dǎo)致分離度的減小[11]?？紤]到溫度對(duì)手性柱使用壽命的影響，最終選擇25 ℃作為分離柱溫。

2.5 方法的線性范圍及定量限

精密吸取(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯母液，配制成0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液，在已優(yōu)化的色譜條件下依次進(jìn)樣，考察峰面積(Y)與樣品質(zhì)量濃度(X)的線性關(guān)系。(2R,3R)-(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯線性方程為:Y1=6000000X-63154(R2=0.9996)；(2S,3S)-(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯線性方程為：Y2=5000000X-79943(R2=0.9995)。線性良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。將母液逐級(jí)稀釋，在上述條件下進(jìn)行檢測(cè)，定量限以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算，結(jié)果為0.008 mg/mL。

2.6 重復(fù)性

取已配制的1.2 mg/mL的(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯溶液，在已優(yōu)化的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。6次進(jìn)樣的分離度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.70%，保留時(shí)間的RSD分別為1.43%、1.42%，重復(fù)性較好。

2.7 方法的應(yīng)用

在已優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)本課題組合成的(2R,3R)-(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯進(jìn)行對(duì)映體過量值測(cè)定，結(jié)果顯示產(chǎn)物對(duì)映體過量值(ee值)可達(dá)92%，見圖3。將該方法應(yīng)用于本課題組合成的其他不對(duì)稱環(huán)氧化磷酸酯化產(chǎn)物的拆分，分離度RS均大于1.8，見圖4。

圖3 (2R,3R)-(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯在Chiralpak AS-H上的色譜圖Fig.3 Chromatogram of (2R,3R)-(2-pentyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate on AS-H column

圖4 (2R,3R)-(2-甲基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯(a)和(2R,3R)-(3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯(b)在Chiralpak AS-H上的色譜圖Fig.4 Chromatograms of (2R,3R)-(2-methyl-3-phenyl-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate (a) and (2R,3R)-(3-pheny-2,3-epoxy propyl)diphenyl phosphate (b) on AS-H column

3 結(jié)論

建立了一種快速拆分(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯光學(xué)對(duì)映體的高效液相色譜方法，在Chiralpak AS-H柱上，以正己烷-異丙醇(85∶15,V/V)為流動(dòng)相，在柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm的條件下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的完全分離。將該方法應(yīng)用于(2-戊基-3-苯基-2,3環(huán)氧丙烷基)二苯基磷酸酯類似物的手性拆分，均取得理想效果。