動(dòng)物源大腸桿菌抗藥性檢測及多抗高抗菌株ERIC圖譜分析

劉玲紅，胡明，商延,3，駱延波，李璐璐， 張印，齊靜 ，張慶，常維山， 劉玉慶

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 濟(jì)南 250100；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；3. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

動(dòng)物源大腸桿菌抗藥性檢測及多抗高抗菌株ERIC圖譜分析

劉玲紅1,2，胡明1，商延1,3，駱延波1，李璐璐1， 張印1，齊靜1，張慶1，常維山1,2， 劉玉慶1

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 濟(jì)南 250100；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；3. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100)

為檢測山東2016年動(dòng)物源大腸桿菌的抗藥情況，并分析多抗高抗菌株間基因重復(fù)一致序列PCR(ERIC-PCR)基因圖譜，探討多抗高抗大腸桿菌ERIC-PCR基因分型與抗藥性之間的關(guān)系，從患病動(dòng)物中分離并鑒定豬源和禽源大腸桿菌110株，用瓊脂稀釋法測定其對(duì)10種抗生素的抗藥情況，并從中挑選20株多抗高抗大腸桿菌進(jìn)行ERIC-PCR，根據(jù)DNA指紋圖譜進(jìn)行聚類遺傳分析。結(jié)果表明，豬源大腸桿菌對(duì)多類抗生素具有抗藥性，對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素和氨芐西林的抗藥率達(dá)100%，對(duì)頭孢噻肟抗藥率較低，為57.14%；禽源大腸桿菌也具有高度抗藥性，對(duì)氟苯尼考抗藥率達(dá)95.51%，對(duì)環(huán)丙沙星抗藥率最低，為61.80%。ERIC分析顯示，多抗高抗菌株譜型分散，為多克隆來源，其基因分型B型與抗藥特性之間呈一定相關(guān)性。表明，動(dòng)物源大腸桿菌抗藥程度高，且呈現(xiàn)高度多重抗藥性，對(duì)不同種類抗生素及同類抗生素不同藥物之間均存在嚴(yán)重的抗藥性。多抗高抗大腸桿菌無明顯種屬特性，其傳播和蔓延對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全都形成潛在的巨大風(fēng)險(xiǎn)。

大腸桿菌；抗藥性；ERIC-PCR；基因型

AbstractThe drug resistance ofE.colifrom animals were detected in Shandong Province in 2016, the gene mapping of Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR (ERIC-PCR) of multidrug resistant strains were analyzed, and then the relationship between ERIC-PCR genotyping and drug resistance of high-resistantE.coliwith multidrug resistance was discussed. Total 110E.colistrains were isolated and identified from diseased swine and avian, and their resistance to 10 kinds of antimicrobials were determined by the agar dilution method. Twenty high-resistant strains with multidrug resistance were selected to carry on the ERIC-PCR, followed by cluster genetic analysis according to the DNA fingerprint. The swine-originE.colistrains possessed serious resistance against several kinds of antimicrobial agents, for example, all strains were tolerant to florfenicol, doxycycline and ampicillin (100%), while a relative lower resistant rate to cefotaxime sodium (57.14%). The same situation was in the avian-originE.colistrains, which had a resistant rate of 95.51% against florfenicol while the lowest rate of 61.80% appeared on ciprofloxacin. Analysis of ERIC showed dispersive fingerprint patterns of high-resistant and multidrug-resistant strains which represented a multiple clone resources, and there were certain correlation between the B genotype and the drug-resistant characteristics. It indicated that animal sourceE.colistrains had high level of drug-resistance and were multidrug-resistant, that was, there were severe antibiotic resistance against not only different kinds of antibiotics but also different drugs of the same kind. The multidrug-resistant and high level-resistantE.colistrains had no apparent species preference, while its spreading and pervading posed a potential threat to the development of animal husbandry and the public health security.

KeywordsEscherichiacoli; Drug resistance; ERIC-PCR; Genotype

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)通常被稱為大腸桿菌，多為人與動(dòng)物的正常菌群，但在不良條件下為條件致病菌，某些種致病性強(qiáng)，能夠引起嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥等[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化發(fā)展，養(yǎng)殖動(dòng)物處于高營養(yǎng)、高密度的飼養(yǎng)環(huán)境中，自身免疫力低下，各種應(yīng)激反應(yīng)和疫苗保護(hù)不完全，極易發(fā)生感染。大腸桿菌作為常在菌群容易成為條件致病菌，引發(fā)大腸桿菌感染，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成危害。從發(fā)病情況來看，大腸桿菌發(fā)病率居動(dòng)物細(xì)菌性疾病全球首位，成為現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中最常見和最難防治的重要疾病之一，給整個(gè)畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

目前獸醫(yī)臨床上，使用抗生素仍是防治大腸桿菌病的首要方法。國內(nèi)外大量研究表明，大腸桿菌極易產(chǎn)生抗藥性，抗藥率逐漸上升，抗藥譜迅速增寬，抗藥性的形成和傳播速度也越來越快[3]。同時(shí)，抗菌藥物的不規(guī)范使用，不僅加劇了在畜禽體內(nèi)的殘留，甚至加速了抗藥菌株或抗藥性基因元件在不同物種間的傳播，給我國畜牧業(yè)的健康快速發(fā)展和公共衛(wèi)生安全帶來了隱患和潛在威脅[4]。另外，國家關(guān)于抗生素的管理正處在摸索與探究中，比如：對(duì)于同類不同抗菌藥物，目前區(qū)分了不同的使用對(duì)象和范圍，此措施能否有效阻斷抗藥性的產(chǎn)生和蔓延還有待于進(jìn)一步研究。

腸桿菌基因間重復(fù)共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC)PCR 以其操作簡便、易實(shí)現(xiàn)、重復(fù)性高、分辨力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),逐漸引起了人們的關(guān)注[5]。本研究于2016年從病死動(dòng)物樣品中收集豬源和禽源大腸桿菌，檢測其對(duì)常用抗生素種類的抗藥性，同時(shí)關(guān)注其對(duì)獸用和醫(yī)用使用范圍有所區(qū)分的同類別不同藥物之間交叉抗藥性，并采用ERIC-PCR方法，探討多抗高抗大腸桿菌ERIC-PCR圖譜與其種屬特異性和傳播之間、大腸桿菌抗藥情況及ERIC-PCR基因分型間的關(guān)系，對(duì)了解大腸桿菌抗藥水平、藥物間交叉抗藥性及開展抗藥菌株抗藥機(jī)制的分子生物學(xué)研究有一定意義。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大腸桿菌ATCC 25922藥敏標(biāo)準(zhǔn)株，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：大腸桿菌顯色培養(yǎng)基ECC，購自上海欣中生物有限公司；MHA瓊脂和MHB肉湯培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

試劑：PCR buffer、dNTP 和TaqDNA聚合酶，均購于天根生化科技(北京)有限公司；DL5000 DNA Marker， 購于寶生物工程(大連)有限公司。

抗生素：氨基糖苷類：慶大霉素(CN)；四環(huán)素類：多西環(huán)素(DOX)；氯霉素類：氟苯尼考(FFC)；β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林(AMP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻呋(CEF)和頭孢噻肟(CEQ)；氟喹諾酮類：恩諾沙星(EN)、環(huán)丙沙星(CIP)和左氧氟沙星(LVX)。以上試劑購自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1 大腸桿菌分離鑒定 將2016年于山東不同地區(qū)養(yǎng)殖場采集的患病雞、豬內(nèi)臟和糞便拭子樣品劃線于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)后挑取單個(gè)藍(lán)色可疑菌落，接種于非選擇性MHA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用MALDI-TOF-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃 VETIK MS)進(jìn)行鑒定，將鑒定為陽性的大腸桿菌保存于30%甘油肉湯中，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大腸桿菌藥物敏感試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，用瓊脂稀釋法對(duì)分離菌株進(jìn)行10種藥物的藥敏試驗(yàn)[6]，測定各菌株的抗藥率，統(tǒng)計(jì)分析豬源、禽源大腸桿菌抗藥性及各菌株的多重抗藥性、交叉抗藥性。

1.2.3 ERIC檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)引物(F: 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，R：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)，由上海生物工程有限責(zé)任公司合成。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，挑取多抗高抗菌株，禽源和豬源各10株，提取DNA，進(jìn)行ERIC-PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性 7 min；90℃變性 30 s，52℃退火 1 min，65℃延伸 8 min，30個(gè)循環(huán)；65℃延伸 16 min，4℃ 保存。根據(jù)電泳圖記錄ERIC指紋圖譜并分析DNA多態(tài)性。有條帶的記為“1”, 沒有條帶的記為“0”,將ERIC-PCR擴(kuò)增的DNA多態(tài)性形成數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行聚類遺傳分析。以相似度>0.75為同一基因型，<0.75為不同基因型[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌分離鑒定

采集樣品經(jīng)過分離鑒定，最終確定共獲得大腸桿菌110株，其中豬源大腸桿菌21株，禽源大腸桿菌89株。

2.2大腸桿菌抗藥性檢測

對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果如圖1，可見，所有菌株抗藥率均較高，其中豬源大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素、氨芐西林和氟苯尼考抗藥率達(dá)100%，對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星抗藥率為90%以上，對(duì)頭孢噻肟抗藥性相對(duì)較低，也在57.14%。禽源大腸桿菌對(duì)氟苯尼考和氨芐西林抗藥率高達(dá)90%以上，對(duì)環(huán)丙沙星抗藥率較低，為61.80%。表明，山東不同動(dòng)物源大腸桿菌抗藥性非常嚴(yán)重。

圖1 豬源和禽源大腸桿菌分離株的抗藥率

2.3大腸桿菌的多重抗藥性

統(tǒng)計(jì)分析110株大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果，多重抗藥性如圖2所示，可見，未發(fā)現(xiàn)完全不抗藥的菌株，僅有1株菌抗1種抗菌藥，其余菌株均表現(xiàn)出對(duì)2種及多種抗菌藥物的抗藥性，其中同時(shí)抗10種抗菌藥的多達(dá)41株(37.27%)，抗6～9種抗菌藥的有62株(56.36%)，抗1～5種抗菌藥的僅占6.36%。

圖2大腸桿菌分離株的多重抗藥性

2.4大腸桿菌對(duì)同類抗生素交叉抗藥性

本研究中，選擇了同屬于第三代頭孢的3種抗生素，即頭孢噻呋、頭孢噻肟和頭孢曲松。其中，前者為動(dòng)物專用抗生素，后兩種為醫(yī)用抗生素。

根據(jù)交叉抗藥率計(jì)算公式[9]：A藥對(duì)B藥的交叉抗藥率(%)=同時(shí)抗A、B藥菌株數(shù)/抗B 藥總菌株數(shù)×100 ,計(jì)算出兩種頭孢菌素之間交叉抗藥性,結(jié)果如表1，顯示頭孢類抗生素間存在非常顯著的交叉抗藥性，每兩種抗生素的交叉抗藥程度多在95%以上，醫(yī)用抗生素和動(dòng)物用抗生素在本試驗(yàn)分離的大腸桿菌抗藥率方面并無區(qū)別。110株大腸桿菌中，對(duì)1種及以上頭孢藥物具有抗藥性的菌株共有81株，其中同時(shí)對(duì)3種頭孢藥物均抗藥的菌株有70株，對(duì)3種藥物的重合抗藥率為86.40%。

表1 對(duì)兩種頭孢類藥物同時(shí)產(chǎn)生抗藥性的菌株調(diào)查結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)括號(hào)外為菌株數(shù)，括號(hào)內(nèi)為交叉抗藥率。下同。

同樣，研究中選擇三種喹諾酮類藥物，即恩諾沙星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星。前者是動(dòng)物專用，后兩者為醫(yī)用。根據(jù)交叉抗藥率公式, 計(jì)算出喹諾酮類兩兩之間交叉抗藥率，結(jié)果如表2，顯示喹諾酮類抗生素不同藥物同樣存在交叉抗藥性。每兩種抗菌藥的交叉抗藥性多高于80%以上。110株大腸桿菌中，對(duì)1種及以上喹諾酮藥物具有抗藥性的菌株共有95株，其中同時(shí)對(duì)3種頭孢藥物抗藥的菌株有65株，3種藥物重合抗藥率為68.40%。

表2 對(duì)兩種喹諾酮類藥物同時(shí)產(chǎn)生抗藥性的菌株調(diào)查結(jié)果

2.5 ERIC指紋圖譜分析

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果綜合評(píng)價(jià)，挑取禽源和豬源多重高抗菌株各10株，進(jìn)行多次ERIC-PCR，獲得穩(wěn)定指紋圖譜。ERIC-PCR指紋圖譜條帶數(shù)約有1～8條，條帶大小主要在200 ～3 000 bp之間，以400 bp和1 800 bp左右為主帶；豬源和禽源指紋圖譜主帶無明顯同源性。禽源4和5泳道指紋圖譜幾乎完全一致，表明4和5菌株可能屬同一菌株；豬源指紋圖譜未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律；禽源和豬源DNA指紋圖譜共表現(xiàn)出19種ERIC譜型，如圖3所示。

注：M代表DL5000 DNA Marker。

圖3禽源和豬源多抗高抗大腸桿菌的ERIC-PCR電泳圖譜

2.6 DNA多態(tài)性聚類分析

由聚類分析樹狀圖(圖4)可知，20株抗藥菌株有8種ERIC-PCR基因型，并且與禽源或豬源沒有相關(guān)性。其中有55%抗藥菌株表現(xiàn)同一ERIC-PCR基因型，即B型，該部分菌株中63.64%菌株表現(xiàn)同樣的抗藥譜，即對(duì)10種抗生素全部抗藥。所選擇菌株中共有10株細(xì)菌對(duì)10種抗菌藥均為抗藥，其中7株都為B型ERIC-PCR基因型。

圖4 多抗高抗菌株聚類分析樹狀圖

3 討論與結(jié)論

近年來,大腸桿菌的抗藥株不斷增多,出現(xiàn)了大量多重抗藥菌。國內(nèi)外研究結(jié)果表明，抗藥性大腸桿菌在全球范圍內(nèi)廣泛存在[10，11]。雷連成[12]、隋慧[13]及賀丹丹[14]等均報(bào)道動(dòng)物源大腸桿菌的抗藥性以多重抗藥為主。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，110株大腸桿菌中僅1株單一抗藥菌株，其余均為多重抗藥菌株。本研究中多重抗藥株高度集中,可能由于獸醫(yī)臨床大量使用抗菌藥治療細(xì)菌性感染，或者在飼料中添加抗生素來促進(jìn)生長和預(yù)防疾病，導(dǎo)致大腸桿菌長期在藥物選擇壓力下產(chǎn)生越來越顯著的抗藥性[15]。同時(shí)，大量抗藥菌的出現(xiàn)可能是菌體攜帶介導(dǎo)抗藥性的質(zhì)粒導(dǎo)致抗藥基因在菌體間傳播。另據(jù)研究報(bào)道，多重抗藥菌的出現(xiàn)，可能是菌體細(xì)胞膜通透性的改變和菌體主動(dòng)外排系統(tǒng)表達(dá)量增加作用的結(jié)果[16，17]。

本研究表明，分離的大腸桿菌不僅對(duì)多種抗生素產(chǎn)生抗藥性，還對(duì)同類抗生素不同藥物存在嚴(yán)重的交叉抗藥性，如頭孢類和喹諾酮類藥物，菌株對(duì)醫(yī)用抗菌藥的抗藥性也很高。雖然此現(xiàn)象可能與養(yǎng)殖場存在用藥不規(guī)范的情況有關(guān)，但作用機(jī)理和治療效果相似的同類抗菌藥不可能同時(shí)大量和重復(fù)使用，因此，高度交叉抗藥性的現(xiàn)象應(yīng)該引起人們的高度重視。一種藥物產(chǎn)生抗藥性，同類產(chǎn)品的其它藥物可能因此而產(chǎn)生交叉抗藥性，所以單純將動(dòng)物專用抗菌藥和醫(yī)用抗菌藥分開，而不考慮交叉抗藥性的問題，不可能阻止抗藥菌株的傳播和蔓延。本研究結(jié)果同類抗生素間存在交叉抗藥性與李筱涵等[18]報(bào)道喹諾酮類藥物間存在交叉抗藥性的結(jié)果一致。喹諾酮類抗菌藥體外誘導(dǎo)抗藥性試驗(yàn)證明，這類藥物之間存在交叉抗藥性是由于有相同的母體結(jié)構(gòu)，同理，頭孢類抗菌藥間存在抗藥性是因?yàn)楹邢嗤沫h(huán)狀結(jié)構(gòu)[19]。交叉抗藥性的檢測可以反映獸醫(yī)臨床抗藥的實(shí)際情況，給獸醫(yī)臨床指導(dǎo)用藥奠定基礎(chǔ)，同時(shí)交叉抗藥性給公共衛(wèi)生領(lǐng)域帶來了挑戰(zhàn)和潛在的威脅。

病原菌給養(yǎng)殖業(yè)帶來高風(fēng)險(xiǎn)，尤其是多抗高抗菌株給實(shí)際生產(chǎn)帶來巨大危害，本文探討了多抗高抗菌株表型與其DNA指紋圖譜間的關(guān)系，分析抗藥菌株同源性、抗藥表型與ERIC-PCR基因型的關(guān)系，探索抗藥菌株產(chǎn)生抗藥性機(jī)制的相似點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)所測菌株譜型非常分散，并且禽源和豬源大腸桿菌之間并無明顯的種屬特異性，這預(yù)示菌株易在不同物種間傳播，增加了包括人在內(nèi)的不同物種共患的可能性。結(jié)果還顯示菌株抗藥性與特定ERIC-PCR基因型之間存在一定程度的關(guān)聯(lián)，具體為對(duì)10種藥物全部抗藥的多抗高抗菌與B型ERIC-PCR基因型存在最大的重合和覆蓋度，表明此基因型的大腸桿菌易形成多重抗藥性，或者是此基因型大腸桿菌具有較強(qiáng)的傳播和蔓延能力，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和世界公共衛(wèi)生安全造成了潛在的極大的威脅因素。

統(tǒng)計(jì)分析動(dòng)物源大腸桿菌抗藥性和抗藥菌株間ERIC基因型間的關(guān)系，有助于從大腸桿菌表型和分子水平多方面檢測大腸桿菌抗藥性,本文將DNA指紋圖譜與抗藥性和同源性聯(lián)系起來，為深入抗藥菌株產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，利用ERIC-PCR技術(shù)研究其DNA 指紋圖譜與抗藥表型的關(guān)系還需更多數(shù)據(jù)的支持,有待進(jìn)一步深入研究。

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DetectionofDrugResistanceofEscherichiacoliIsolatedfromAnimalsandERICAnalysisofMultipleResistantStrains

Liu Linghong1,2, Hu Ming1, Shang Yan1,3, Luo Yanbo1, Li Lulu1, Zhang Yin1, Qi Jing1, Zhang Qing1, Chang Weishan1,2, Liu Yuqing1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan250100,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China; 3.SchoolofLifeSciences,ShandongUniversity,Jinan250100,China)

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.09.001

2017-06-26

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CXGC2017A01)；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目“山東省肉雞業(yè)公共衛(wèi)生模式建立的示范”

劉玲紅(1991—)，女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。 E-mail：1074150258@qq.com

常維山(1960—)，男，山東泰安人，教授，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。 E-mail:wschang@sdau.edu.cn 劉玉慶(1969—)，男，山東煙臺(tái)人，研究員，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究。E-mail: liuiuqing@163.com

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