王瑞君，成莉鳳，馮湘沅，段盛文，鄭科，劉志遠(yuǎn)，曾潔，劉正初1，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，長(zhǎng)沙410205；3.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春336000）

一株產(chǎn)耐熱甘露聚糖酶細(xì)菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)初探

王瑞君1，2，3，成莉鳳2，馮湘沅2，段盛文2，鄭科2，劉志遠(yuǎn)2，曾潔2，劉正初1，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，長(zhǎng)沙410205；3.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春336000）

為獲得耐熱甘露聚糖酶，從天然高溫泉水中篩選出了一株產(chǎn)甘露聚糖酶的細(xì)菌。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)等手段，確定所篩選的菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。并研究了溫度、pH值和金屬離子等因素對(duì)甘露聚糖酶活力的影響。結(jié)果顯示，該酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和5.0。Co2＋和Al3＋對(duì)該酶的活力有抑制作用，Mn2＋、K＋和Ca2＋對(duì)該酶活力有一定的促進(jìn)作用，其它離子對(duì)酶活力沒(méi)有顯著影響。該菌株生產(chǎn)的甘露聚糖酶具有耐熱偏酸性的特點(diǎn)。該研究為甘露聚糖酶制劑產(chǎn)業(yè)提供了可靠的菌種資源，可用于紡織、食品、飼料等方面，并為將來(lái)進(jìn)一步研究其用途奠定了基礎(chǔ)。

耐熱甘露聚糖酶；地衣芽孢桿菌；篩選；酶學(xué)性質(zhì)

甘露聚糖屬于半纖維素，根據(jù)側(cè)鏈的不同主要有甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等幾種［1］，存在于植物細(xì)胞壁中。水解甘露聚糖的關(guān)鍵酶是β－甘露聚糖酶，其主要水解以β－1，4－D－吡喃甘露糖苷鍵為主鏈的甘露聚糖［2］。

甘露聚糖酶可應(yīng)用于紡織［3］、造紙［4］、飼料［5］、食品［6］、醫(yī)藥以及石油［7］等領(lǐng)域。其可由動(dòng)物、植物、微生物等生物分泌產(chǎn)生，但主要來(lái)源于細(xì)菌、真菌等微生物。微生物具有生境多樣、種類(lèi)多樣的特點(diǎn)，從而使其產(chǎn)生的甘露聚糖酶也具有多樣性，此外，微生物還具有生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)物易提純等優(yōu)點(diǎn)，使微生物來(lái)源的甘露聚糖酶具有廣泛的應(yīng)用范圍。

現(xiàn)在已商業(yè)化的甘露聚糖酶主要來(lái)源于曲霉、木霉等少數(shù)幾種真菌類(lèi)微生物，其它來(lái)源的微生物類(lèi)甘露聚糖酶由于酶活力低、生產(chǎn)成本高而應(yīng)用不廣，并且多數(shù)甘露聚糖酶存在耐熱性不高的缺點(diǎn)，導(dǎo)致其在生產(chǎn)、運(yùn)輸中生物活性不穩(wěn)定。因此，篩選耐熱性強(qiáng)、酶活高的甘露聚糖酶是甘露聚糖酶研究的一個(gè)重要方向［8］。最近已發(fā)現(xiàn)一些嗜熱或耐熱細(xì)菌產(chǎn)生的酶具有良好耐熱性，具備一些中溫微生物產(chǎn)生的酶所不具備的優(yōu)點(diǎn)，耐熱酶的最適作用溫度在60℃以上，降低了雜菌的污染，減少了雜菌代謝產(chǎn)物的干擾；較高的反應(yīng)溫度，可提高酶的催化能力和催化效率。已有研究者開(kāi)始從嗜熱環(huán)境中篩選產(chǎn)甘露聚糖酶的細(xì)菌［9］。本文擬從江西宜春溫泉中分離一株產(chǎn)甘露聚糖酶的細(xì)菌，并研究其酶學(xué)性質(zhì)，旨在為甘露聚糖酶在高溫環(huán)境下的儲(chǔ)存和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

江西省宜春市溫湯鎮(zhèn)溫泉水。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母膏0.5 g，胰蛋白胨 1 g，NaCl 1 g，魔芋粉 0.5 g，水 100 mL。選擇培養(yǎng)基［10］：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.02%曲利苯藍(lán)和2%的瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)于OMEGA（美國(guó)）公司；細(xì)菌通用引物27F：5’－AGTTTGATCCTGGCTCAG－3’和1492R：5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；魔芋膠購(gòu)于成都路特實(shí)業(yè)有限公司（葡甘聚糖純度＞95%）。

1.2 方法

1.2.1 分離產(chǎn)甘露聚糖酶的嗜熱菌株

用無(wú)菌容器采集溫泉水，量取溫泉水10 mL，加入40 mL的富集培養(yǎng)基中，共3個(gè)樣品。分別置于50、55、60℃條件下培養(yǎng)6 h。發(fā)酵液10倍梯度稀釋后選擇合適的稀釋度涂布于選擇培養(yǎng)基上。分別置于50、55、60℃條件下培養(yǎng)16～24 h，挑取水解圈與菌落直徑之比（D／d）較大的菌落接種于選擇培養(yǎng)基中劃線純化，純化后的菌株接種于富集培養(yǎng)基中，150 r／min過(guò)夜培養(yǎng)后，檢測(cè)酶活力，酶活力較大者為候選菌株。

1.2.2 菌種鑒定

挑取酶活力最大者在LB瓊脂平板上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)并挑取單菌落進(jìn)行芽孢染色和革蘭氏染色。進(jìn)行有關(guān)的生化試驗(yàn)，方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［11］。

挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，55℃過(guò)夜培養(yǎng)。用細(xì)菌基因組提取試劑盒（OMEGA）提取細(xì)菌基因組。以提取的基因組DNA為模板，以細(xì)菌通用引物27F和1492R為上下游引物，進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)得的序列提交到NCBI網(wǎng)站，使用BLAST搜索相似序列，找到同源性較高（＞98%）的序列，利用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 甘露聚糖酶酶活的測(cè)定

以2%接種量接入富集培養(yǎng)基中，55℃、150 r／min過(guò)夜培養(yǎng)。菌液5000 r／min，4℃離心10 min，收集上清液即為粗酶液。

在檸檬酸－NaH2PO4緩沖液中配制5 g／L的魔芋膠溶液，粗酶液1 mL加入到1 mL的魔芋膠底物中，60℃水浴反應(yīng)5 min，采用DNS法測(cè)定所釋放的還原糖［12］。酶活力單位定義為每分鐘水解魔芋膠產(chǎn)生1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的研究

（1）不同pH值對(duì)酶活力的影響：采用不同pH（3.8～7.0）檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液溶解魔芋膠底物，在60℃下，按照1.2.3的方法測(cè)定酶活，以最大值為100%，分別計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活。

（2）金屬離子對(duì)酶活力的影響：將粗酶液和金屬離子的母液混勻，使酶液中金屬離子的終濃度為1 mmol／L或0.5 mmol／L，測(cè)定酶活，甘露聚糖酶粗酶液中加入相同體積不含金屬離子的超純水作為空白對(duì)照。金屬離子包括 Na＋、Ca2＋、Mn2＋、Mg2＋、Zn2＋、Fe2＋、Co2＋、Cu2＋、K＋、Al3＋，以其氯化物形式檢測(cè)金屬離子對(duì)酶活的影響。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，挑取了D／d≥2的菌株，從50、55℃培養(yǎng)的選擇培養(yǎng)基上篩選到10株產(chǎn)甘露聚糖酶的細(xì)菌，如圖1所示。表1結(jié)果顯示，挑取水解圈較大的菌落純化后，測(cè)得Mas1菌株酶活力最大，故選擇其作為試驗(yàn)菌株。

圖1 10株產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的水解圈Fig.1 The hydrolysis halos of ten strains producingmannanases

表1 10株菌的D／d及酶活力Tab.1 The ratio of D／d and enzyme activity of ten strains

2.2 菌株的鑒定

菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落中間干燥，邊緣濕潤(rùn)不整齊（圖2）。革蘭氏染色結(jié)果表明，嗜熱菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌。用孔雀綠進(jìn)行芽孢染色的結(jié)果見(jiàn)圖3，圖中可見(jiàn)綠色的芽孢和紅色的菌體，圖3表明，菌體內(nèi)部有膨大的芽孢。菌株Mas1生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。鑒定結(jié)果與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［11］所描述的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的生化特征相似。

圖2 菌落形態(tài)Fig.2 Colonymorphology

圖3 菌株Mas1的芽孢染色Fig.3 Endospore stain of strain Mas1

表2 Mas1菌株生化鑒定結(jié)果Tab.2 Biochemical properties of isolated strain Mas1

利用NCBIGenBank中的Blast程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，結(jié)果表明，菌株Mas1的16SrDNA序列與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源性達(dá)99%。來(lái)自菌株Mas1的16SrDNA序列與相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖4）。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖可知，Mas1與菌株Bacillus licheniformis D50在同一個(gè)進(jìn)化分支上，表明兩者有最近的親緣關(guān)系。結(jié)合生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定該菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖4 Neighbor－joining法構(gòu)建的Mas1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 A neighbor－joining phylogenetic tree of the strain Mas1

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 pH對(duì)甘露聚糖酶活力的影響

為確定pH對(duì)甘露聚糖酶活力的影響，在60℃條件下測(cè)定了不同pH值下該酶的活力。由圖5可知，該酶的最適pH值為5.0。在pH 4.6～5.8的范圍內(nèi)，該酶的相對(duì)酶活力保持在70%以上，這一結(jié)果表明該甘露聚糖酶為偏酸性酶。

圖5 不同pH值對(duì)甘露聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of pH onmannanase activity

2.3.2 溫度對(duì)酶活力的影響

在pH 5.0條件下，測(cè)定了不同溫度對(duì)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，在溫度低于60℃時(shí)，隨著溫度的升高相對(duì)酶活力升高。高于60℃后，酶活力快速下降，在75℃時(shí)的相對(duì)酶活力只有24.5%，在40～70℃范圍內(nèi)相對(duì)酶活力可保持近60%以上。在60℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高，60℃為該酶反應(yīng)的最適溫度。已有研究［13］認(rèn)為耐熱酶的最適溫度范圍為60～80℃，超嗜熱酶最適反應(yīng)溫度大于80℃，根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，Mas1產(chǎn)生的甘露聚糖酶為耐熱酶。

圖6 甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度Fig.6 Effect of temperature on mannanase activity

2.3.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

金屬離子對(duì)甘露聚糖酶的影響見(jiàn)表3。數(shù)據(jù)表明，在1、0.5 mmol／L的濃度下，Ca2＋和Mn2＋對(duì)酶活力有促進(jìn)作用。在1 mmol／L濃度下，Mg2＋、K＋、Cu2＋等離子對(duì)酶活力有一定的促進(jìn)作用。在兩種濃度下，Al3＋與Co2＋對(duì)酶活力有抑制作用，其它離子對(duì)酶活力沒(méi)有明顯的抑制作用。

表3 金屬離子對(duì)甘露聚糖酶的影響Tab.3 Effect ofmetal ions on activity ofmannanase

3 討論

常見(jiàn)的產(chǎn)甘露聚糖酶的細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性的芽孢桿菌［14，15］，革蘭氏陰性的產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）［16］、路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）［17］等。已有的研究數(shù)據(jù)表明［18，19］，篩選的產(chǎn)甘露聚糖酶的芽孢類(lèi)菌株中，枯草芽孢桿菌較多，地衣芽孢桿菌較少。本研究從江西溫泉中篩選到一株產(chǎn)甘露聚糖酶的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和分子鑒定，確定為地衣芽孢桿菌，豐富了產(chǎn)甘露聚糖酶菌種的多樣性。

甘露聚糖酶的性質(zhì)因來(lái)源不同而不同。圖5、6顯示，從溫泉中分離的菌株Mas1分泌的甘露聚糖酶最適pH值為5.0，在酸性范圍保持較高的酶活力；該酶的最適溫度為60℃，在40～70℃范圍保持近60%以上的酶活力。唐嘉婕等［20］從臭豆腐鹵液中篩選到的短小芽孢桿菌所分泌的甘露聚糖酶最適pH和反應(yīng)溫度為分別為6.0和40℃。吳華偉［21］從土壤中篩選的菌株產(chǎn)甘露聚糖酶的最適pH和反應(yīng)溫度分別為6.5和50℃。Mas1最適反應(yīng)溫度為60℃，

甘露聚糖酶在發(fā)酵生產(chǎn)或使用中常遇到鈉、鉀、鈣、鎂、銅、鋅、鐵、錳、鋁或鈷等金屬離子，這些金屬離子可能對(duì)甘露聚糖酶有抑制或激活作用。為了更好地了解這些金屬離子對(duì)酶的影響，本文研究了這些金屬離子對(duì)甘露聚糖酶的影響。由結(jié)果可知，Ca2＋和Mn2＋對(duì)酶活力有激活作用，Al3＋與Co2＋對(duì)酶活力有抑制作用，其它離子對(duì)酶活力沒(méi)有明顯的抑制作用。金屬離子對(duì)甘露聚糖酶的影響較為復(fù)雜，表現(xiàn)在不同來(lái)源的甘露聚糖酶對(duì)金屬離子的要求不同：Ca2＋、K＋、Zn2＋、Na＋、Mg2＋等離子對(duì)來(lái)源于海洋微生物的甘露聚糖酶活力有抑制作用［22］。本研究中的甘露聚糖酶對(duì)常見(jiàn)的金屬離子具有較好的耐受性，可以有較廣的應(yīng)用范圍。

不同性質(zhì)的甘露聚糖酶可以滿足不同的需求。本文篩選到了一株產(chǎn)耐熱偏酸性甘露聚糖酶的菌株，有關(guān)其產(chǎn)生的甘露聚糖酶的應(yīng)用需作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文從江西溫泉中篩選到產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株，鑒定結(jié)果表明，所篩選的菌株為地衣芽孢桿菌。該菌株產(chǎn)生的甘露聚糖酶在60℃偏酸性條件下具有較高的酶活力，該酶對(duì)發(fā)酵過(guò)程或使用中遇到的常見(jiàn)金屬離子具有較好耐受性。

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Screening of a Thermophilic Mannanase Producing Bacterium and Studies on the Enzymatic Properties of Mannanase

WANG Ruijun1，2，3，CHENG Lifeng2，F(xiàn)ENG Xiangyuan2，DUAN Shengwen2，ZHENG Ke2，LIU Zhiyuan2，ZENG Jie2，LIU Zhengchu1，2*
（1.College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China；3.College of Chemistry and Bioengineering，Yichun University，Yichun，Jiangxi336000，China）

A mannanase producing bacterial strain named Mas1 was newly isolated from a hot spring in Jiangxi Province.Mas1 was identified as B.licheniformis by 16SrRNA gene sequence analysis，morphological detection，physiological and biochemical identification.The effectof temperature，pH andmetal ions on the activity and stability of crudemannanases from B.licheniformis Mas1 was studied.The results showed that the optimal temperature and pH for themannanase activity was 60℃and 5.0 respectively；Co2＋and Al3＋were themosteffective inhibitor of the enzyme activity，while Mn2＋，K＋and Ca2＋could promote the activity of the enzyme，and other ions had no significant effect on the enzyme activity.This strain could be used for the production ofmannan－degrading enzymes，and has great potential for applications in textile，food，feed and other fields.

thermophilic mannanase；Bacillus licheniformis；screening；enzymatic properties

Q556

A

1671－3532（2017）05－0234－07

2017－07－20

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（ASTIP－IBFC08）；湖南省自然科學(xué)基金（2016 jj3126）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（CARS－19－E24）

王瑞君（1970－），女，副教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物研究。E－mail：wruijun＠163.com

*通訊作者：劉正初（1956－），男，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物研究。E－mail：ibfclzc＠189.cn