采用不同菌種發(fā)酵對臍橙殘次果飼料真蛋白含量的影響

張 強，陳榮強，孔智偉，鐘如意，劉瑞平，郭添福，2*

（1.贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341401；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330045）

采用不同菌種發(fā)酵對臍橙殘次果飼料真蛋白含量的影響

張 強1，陳榮強1，孔智偉1，鐘如意1，劉瑞平1，郭添福1，2*

（1.贛州市畜牧研究所，江西 贛州 341401；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330045）

通過采用單一菌種、雙菌組合發(fā)酵，旨在提高臍橙殘次果中真蛋白含量，開發(fā)畜禽發(fā)酵飼料，解決臍橙殘次果未經(jīng)處理對環(huán)境污染和畜牧業(yè)面臨的優(yōu)質(zhì)植物蛋白飼料資源緊缺問題。結(jié)果表明：采用枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合的優(yōu)選菌種配伍并添加纖維素酶，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量最高達到15.59%，與對照組相比提高了12.15%。

臍橙殘次果；菌種；發(fā)酵飼料；真蛋白

贛南作為全國最大的臍橙主產(chǎn)區(qū)，被譽為“世界橙鄉(xiāng)”，2016年臍橙種植面積達10.47萬公頃，總產(chǎn)量128萬噸，產(chǎn)值達51.2億元。因貯藏能力嚴重不足，深加工滯后，每年殘次果達30萬噸以上，導(dǎo)致不符合標(biāo)準(zhǔn)的臍橙殘次果無法加工轉(zhuǎn)化，大部分廉價出售、丟棄或以廢棄物處理，沖擊市場價格，造成嚴重的環(huán)境污染和資源浪費。開發(fā)臍橙殘次果發(fā)酵飼料，有利于解決臍橙殘次果未經(jīng)處理對環(huán)境污染和畜牧業(yè)面臨的優(yōu)質(zhì)植物蛋白飼料資源緊缺問題，促進經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展。

目前，利用臍橙殘次果制作發(fā)酵飼料的相關(guān)報道較少，并且未有研究菌種與臍橙殘次果發(fā)酵飼料真蛋白含量的相互關(guān)系的文獻資料。而關(guān)于柑橘皮渣在飼料工業(yè)上利用的文獻則相對多一些。吳厚玖等[1]利用柑橘皮生產(chǎn)發(fā)酵飼料，發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量、氨基酸含量、維生素含量都得到了增加。周煉等[2]對甜橙皮渣發(fā)酵進行了菌種篩選，研制出了一種強化蛋白飼料，該飼料樣品的粗蛋白含量比相應(yīng)對照高出近80%。鐘良琴等[3]對利用柑橘廢渣生產(chǎn)單細胞蛋白進行了研究，結(jié)果表明，柑橘廢渣生產(chǎn)單細胞蛋白飼料真蛋白含量最高。2011年宋睿等[4]用響應(yīng)面法對冰糖橙皮固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)菌體蛋白進行了研究，得到經(jīng)優(yōu)化后真蛋白含量由19.93%提高到23.85%。Nwabueze 等[5]利用柑橘皮渣生產(chǎn)單細胞蛋白，研究試驗得出生產(chǎn)單細胞最優(yōu)的生長情況是在進行分批發(fā)酵時，當(dāng)pH 5.5、溫度為36 ℃時的12 h 發(fā)酵周期內(nèi)，4%柑橘廢棄物制造了57%粗蛋白。

菌種的選擇對混菌發(fā)酵臍橙殘次果生產(chǎn)菌體蛋白飼料具有重要作用。芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌是常用的生產(chǎn)菌體蛋白飼料的菌種。本文首次以臍橙殘次果為發(fā)酵原料，研究臍橙殘次果在不同菌種發(fā)酵培養(yǎng)下飼料真蛋白含量的變化，通過單一菌種、雙菌組合發(fā)酵試驗，研究菌種對臍橙殘次果發(fā)酵飼料的影響?？莶菅挎邨U菌進入動物腸道能迅速萌發(fā)成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高飼料利用率、增強動物機體免疫力，從而提高動物的健康水平和生產(chǎn)性能[6]。因此，在雙菌組合發(fā)酵試驗中，本文選取枯草芽孢桿菌作為一種發(fā)酵菌種；通過選用一株菌種與枯草芽孢桿菌進行雙菌組合發(fā)酵試驗，研究不同雙菌組合對發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量的影響。在雙菌組合發(fā)酵基礎(chǔ)上，通過向固態(tài)培養(yǎng)基中添加纖維素酶，考察其對發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

1.1.1 原料

粉碎臍橙殘次果、麩皮。

1.1.2 菌種

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌，購買于河南君安生物科技有限公司產(chǎn)品；安琪高活性干酵母，市售；產(chǎn)朊假絲酵母，購買于無錫拜弗德生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 酶

纖維素酶，購買于濟南天天香有限公司。

1.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎臍橙殘次果50%，麩皮45%，尿素2%，水3%等。121 ℃滅菌 30 min。

1.3 主要試劑及儀器

試劑：濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司，分析純；硫酸鉀，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純。

儀器：LAC-5080S 高壓滅菌鍋，上海博訊儀器儀表有限公司；粉碎機，河北金琦機械廠；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；FA2004電子天平，上海上平儀器有限公司；250 mL凱氏燒瓶，蜀牛；半微量定氮蒸餾器，上海昕滬實驗設(shè)備有限公司；DK-98-Ⅱ電爐，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 單一菌種發(fā)酵試驗

試驗組：將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、安琪酵母、產(chǎn)朊假絲酵母的菌粉分別以0.1%的接種量，接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。(30±1) ℃下發(fā)酵3 d后，將發(fā)酵產(chǎn)物在102 ℃下烘干，粉碎，進行真蛋白含量測定，每個處理3 次平行試驗。

對照組：以未接菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照試驗。在102 ℃下烘干，粉碎，進行真蛋白含量測定，測得的數(shù)值加上所加菌粉的蛋白含量，作為對照組的真蛋白含量數(shù)值。

1.4.2 雙菌發(fā)酵試驗

采用枯草芽孢桿菌和一株其他菌種的雙菌組合方式進行雙菌發(fā)酵試驗，兩種菌種的菌粉均采用0.1%的接種量，其余同單一菌種發(fā)酵試驗。

1.4.3 添加纖維素酶試驗

將枯草芽孢桿菌、乳酸菌的菌粉以0.1%的接種量，纖維素酶0.01%的量，接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其余同單一菌種發(fā)酵試驗。

1.5 真蛋白含量測定

圖1 不同菌種對發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量、粗纖維含量的影響

圖2 雙菌組合對發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量的影響

在樣品水溶液中加入過量硫酸銅，在堿性條件下，純蛋白被氫氧化銅沉淀，用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的測定方法測定其含氮量[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用DPS7.05 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，多重比較采用Duncan 新復(fù)極差法分析，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種發(fā)酵試驗

將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、安琪酵母、產(chǎn)朊假絲酵母分別接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵3 d后測定發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量，試驗結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，菌體發(fā)酵后，真蛋白含量有極顯著性升高 (P＜0.01)，其中安琪酵母發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量增加幅度最大，與對照組相比增加了5.24%，達到14.52%，說明安琪酵母提高發(fā)酵飼料真蛋白含量的能力較強。菌體發(fā)酵后，與對照組相比枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌試驗組的粗纖維含量有極顯著降低 (P＜0.01)，分別降低3.91%、3.70%，而其他3種菌無顯著性差異，說明枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌有一定的分解纖維素能力，而另外3種菌分解纖維素的能力不強。

由以上結(jié)果可以看出，不同菌種對臍橙殘次果發(fā)酵飼料中真蛋白含量的影響差別較大。其中，安琪酵母發(fā)酵后產(chǎn)物中真蛋白含量相對較高，可能是由于安琪酵母合成菌體蛋白能力較強。

2.2 雙菌發(fā)酵試驗

雙菌組合接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵3 d后測定發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可看出，2種不同的菌種混合發(fā)酵臍橙殘次果，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較對照組有極顯著升高 (P＜0.01)，但枯草芽孢桿菌和安琪酵母組合除外?？莶菅挎邨U菌和乳酸菌組合，真蛋白含量增加幅度最大，與對照組相比增加了6.65%，達到14.82%，說明枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合提高飼料真蛋白能力較強。枯草芽孢桿菌和安琪酵母組合，真蛋白含量增加幅度最小，說明枯草芽孢桿菌和安琪酵母組合提高飼料真蛋白能力相對較弱。

圖3 加纖維素酶對發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量、粗纖維含量的影響

由以上分析看出，不同雙菌組合發(fā)酵臍橙殘次果飼料對真蛋白含量的影響較大?？莶菅挎邨U菌和乳酸菌組合，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白的含量高于對應(yīng)的單一菌種，一方面可能是雙菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵能更充分利用發(fā)酵基質(zhì)，另一方面可能是菌種可形成了菌種間的互惠共生關(guān)系，從而促進真蛋白的生成。

2.3 添加纖維素酶試驗

將枯草芽孢桿菌、乳酸菌、纖維素酶加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵3 d后測定發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可看出，加纖維素酶組，發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量較對照組有極顯著降低 (P＜0.01)，與對照組相比降低了10.33%，粗纖維含量降至為8.25%，說明添加的纖維素酶對降低臍橙殘次果飼料粗纖維含量效果顯著。加纖維素酶組，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量較對照組有顯著升高 (P＜0.01)，與對照組相比提高了12.15%，達到15.59%，而圖2中枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合的真蛋白含量僅提高6.65%，說明添加纖維素酶，可提高發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量。

由以上分析看出，添加纖維素酶，可明顯降低發(fā)酵產(chǎn)物中粗纖維含量，使得發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量進一步提升。

3 討論

通過采用雙菌組合發(fā)酵臍橙殘次果，結(jié)果顯示有的雙菌組合真蛋白含量高于單一菌種發(fā)酵，如枯草芽孢桿菌和乳酸菌組合真蛋白含量高于對應(yīng)的單一菌種，這與聞學(xué)政等[8]以柑橘皮渣為發(fā)酵原料試驗得出的結(jié)論相似。楊柳燕等[9]文獻也有類似的報道，酵母菌可利用霉菌降解纖維素生成的葡萄糖進行生物合成，形成了霉菌和酵母菌間的共生關(guān)系，從而具有較強的轉(zhuǎn)化纖維素能力和菌體蛋白合成能力。但是，也有的雙菌組合真蛋白含量低于單一菌種發(fā)酵，這可能是因為菌種間存在抑制作用。

枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生多種消化酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等[10]。試驗結(jié)果顯示，使用的枯草芽孢桿菌對粗纖維有一定的降解作用，通過補加纖維素酶，增強對臍橙殘次果飼料中粗纖維的降解作用，同時菌種可以利用纖維素酶降解纖維素生成的葡萄糖進行生物合成，促進菌體蛋白的合成，提高飼料真蛋白含量。

4 結(jié)論

在單一菌種發(fā)酵試驗中，安琪酵母發(fā)酵臍橙殘次果飼料的真蛋白含量有較大幅度提高。在雙菌組合發(fā)酵試驗中，臍橙殘次果發(fā)酵生產(chǎn)活性蛋白飼料的優(yōu)選雙菌配伍為枯草芽孢桿菌和乳酸菌。采用枯草芽孢桿菌和乳酸菌優(yōu)選雙菌配伍并添加纖維素酶，發(fā)酵3 d后，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白含量達到15.59%，比未發(fā)酵的對照組提高了12.15%。說明，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和纖維素酶配伍發(fā)酵，能顯著提高臍橙殘次果中真蛋白含量。

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2017-09-02）

江西省星火計劃重點項目（20151BBF61033）；江西省星火計劃重點項目（20161BBF61030）江西省科技支撐計劃農(nóng)村領(lǐng)域項目（20142BBF60050）

張強，碩士，生物工程專業(yè)；15779092391

*通訊作者：郭添福，博士生，動物遺傳育種與繁殖專業(yè)；高級畜牧獸醫(yī)師；13407978908