徐湛寧，李福貴，陳 杰，蔣霞云，鄒曙明

(上海海洋大學農業(yè)部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

草魚鰓組織蛋白雙向電泳技術的建立及優(yōu)化

徐湛寧，李福貴，陳 杰，蔣霞云，鄒曙明

(上海海洋大學農業(yè)部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

為建立并優(yōu)化草魚鰓蛋白質組雙向電泳的技術體系，實驗將草魚鰓經(jīng)裂解處理后，通過固相pH梯度膠條進行一向等電聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行蛋白分離，對不同的裂解液配方、蛋白純化方法、IPG膠條的分離范圍、上樣量和染色方法等進行了探索和優(yōu)化，并應用lmage Master 2D Platinum 7.0軟件對電泳圖譜進行了分析。結果表明：采用裂解液中添加DTT來取代Tris和TBP、選擇分離范圍為pH4-7的IPG膠條和150 μg的主動水化上樣，電泳結束后對凝膠進行硝酸銀染色，獲得了覆蓋范圍廣、低背景、高分辨率、適合差異蛋白分析的雙向電泳參考圖譜。

草魚(Ctenopharyngodonidella)；鰓蛋白質；雙向電泳；蛋白質組學

Abstract：In order to establish and optimize the two-dimensional electrophoresis(2-DE) system for proteomic analysis on the gill of Grass carp (Ctenopharyngodonidella)，protein samples of grass carp gill were separated by lysis.Immobilized pH gradient(IPG) strips was used to perform isoelectric focusing electrophoresis(the first dimension),and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) served as the protein separation.By optimizing different lysate formulations and protein purification methods，different immobilized pH gradients(IPG) gel strips，as well as varied loading amount and staining methods were investigated.The proteins were successfully isolated from grass carp gill and were separated by 2-DE.Image Master 2D Platinum 7.0 analysis software was applied to analyze the 2-DE images.The results showed that the quality of 2-DE profiles was significantly improved by replacing Tris and TBP with DTT in lysis buffer，loading 150 μg samples on the pH 4-7 immobilized pH gradients (IPG) strips，and staining with silver nitrite.In consequence，Compared with other methods the 2D-gels profiles with wider pH molecular weight range，lower background noise，higher resolution and more applicable for variant analysis were obtained by using this method consequently.

Keywords：Ctenopharyngodonidella;gill protein;two-dimensional electrophoresis;proteomics

蛋白質組學(Proteomics)是對生物蛋白組(Proteome)的分析與檢測，即對蛋白質的數(shù)量、性質、功能、蛋白質之間相互作用及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關系的研究，已成為當前生命科學研究的熱門領域[1,2]。蛋白質組分析主要通過蛋白質混合物的分離和質譜分析(Massspectrometry)兩步程序完成。

雙向電泳技術(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)作為蛋白質組學研究的核心技術之一，是以蛋白質等電點和分子大小的不同作為標準，將蛋白質從混合物中分離出來[3]，具有較高的分辨率和靈敏度的特點，目前已成為檢測和分析復雜蛋白質組分的一種有效方法[1]。目前，蛋白質組學研究已逐漸延伸到食品科學及水產科學方面，但仍處于起步階段[4-8]。已有關于西施舌(Coelomactraantiquate)鰓[9]、草魚(Ctenopharyngodonidella)腎臟[10]、青鳉(Oryziaslatipes)肝臟[11]、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)肌肉[12]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)肌肉[13]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)表皮[14]等進行蛋白質雙向電泳技術體系建立的研究。對于草魚鰓蛋白質雙向電泳體系的建立尚未見報道。

草魚(Ctenopharyngodonidella)屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)草魚屬(Ctenopharyngodon)，具有快速生長，個體大，肉質肥嫩鮮美，肌間刺少等優(yōu)點[15]，是我國主要的淡水魚養(yǎng)殖種類之一。不同物種，不同組織的雙向電泳體系所使用的條件存在較大差異[16]，本實驗以草魚為實驗材料，為探究草魚鰓蛋白質雙向電泳技術體系的最佳條件，通過對不同裂解液配方、蛋白純化方法、IPG膠條的分離范圍、上樣量和染色方法等條件進行探索，優(yōu)化雙向電泳體系的關鍵步驟，建立了草魚鰓雙向電泳參考圖譜。目前有研究表明草魚鰓在抗呼腸孤病毒免疫方面起著重要的作用[17]，并且當下缺乏鰓對低氧反應的分子機制了解，建立的雙向電泳參考圖譜可為后續(xù)抗病毒和低氧脅迫下草魚鰓蛋白質組學研究提供技術支持，也為其它魚類的鰓蛋白質組學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用草魚取自上海海洋大學農業(yè)部團頭魴遺傳育種中心。實驗前將體重(20±2)g的草魚置室內養(yǎng)殖缸中充氣暫養(yǎng)3 d，水溫21 ℃，使其適應實驗室內養(yǎng)殖環(huán)境。在冰上快速取出鰓組織放入RNase free EP管中，液氮速凍并置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

IPG干膠條、IPG Buffer，2D Clean-up試劑盒購自美國GE公司；二硫蘇糖醇(DTT)、CHAPS、乙二胺四乙酸(EDTA)、四甲基乙二胺(TEMED)、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、瓊脂糖、尿素、硫脲、丙烯酰胺、碘乙酰胺、過硫酸銨、甘氨酸，Bradford蛋白定量試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。其他試劑均使用分析純試劑。

Milli-Q Sythesis超純水系統(tǒng)(上海瑞楓生物科技有限公司)；Smart Spec TM Plus分光光度計(美國Bio-Rad公司)；5180R臺式高速大容量離心機(德國Eppendorf公司)；AUY220型電子分析天平(日本島津公司)；Ettan IPG-phor II型等電聚焦電泳儀、Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)(美國GE公司)；超聲波破碎儀(上海比朗儀器制造有限公司)及 Bio-6000掃描儀(上海中晶科技有限公司)。

1.3 草魚鰓組織蛋白的提取與純化

取草魚鰓250 mg，用研缽加液氮研磨成粉末狀，將粉末分別加入1 mL含蛋白酶抑制劑的裂解液中，震蕩搖勻后于冰上裂解10 min，再加入2%(v/v)IPG buffer和40 mmol/L DTT或10 mmol/L Tris、2 mmol/L TBP，震蕩搖勻于冰上裂解10 min。裂解結束后于低溫(4 ℃)離心機12 000 r/min，30 min取中上層澄清液，作為提取的草魚鰓組織蛋白樣品。其中裂解液試驗了兩種配方，配方Ⅰ：1 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、2%(v/v)IPG buffer、10 mmol/L Tris、2 mmol/L TBP)加三種蛋白酶抑制劑各5 μL(蛋白酶、磷酸酶、PMSF)；配方Ⅱ：1 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、2%(v/v)IPG buffer、40 mmol/L DTT)加三種蛋白酶抑制劑各5 μL(蛋白酶、磷酸酶、PMSF)。

蛋白質的純化方法設2組對照，A：丙酮沉淀法，取200 μL上清液，加入4倍體積丙酮溶液(-20 ℃預冷1 h)，混勻，-20 ℃沉淀過夜。4 ℃離心(12 000 r/min，30 min)去上清，獲得蛋白沉淀，用水化液冰上重新溶解蛋白，將其溶于1 mL加入0.28%(m/v)DTT和0.5%(v/v)IPG buffer緩沖液的硫脲水化緩沖液中，冰浴放置30 min，每隔10 min震蕩30 s，4 ℃離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液備用。B：2D Clean-up試劑盒法，將A中同體積上清液按照說明書操作，所得上清液備用。采用Bradford蛋白定量法，直接上樣或分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 第一向等電聚焦電泳

參照Ettan IPG-phor II型等電聚焦系統(tǒng)使用指南進行。將IPG干膠條從-20 ℃冰箱取出于室溫放置30 min，IPG膠條分別使用pH3-10和pH4-7兩種分離范圍，膠條長度均為24 cm。取草魚鰓蛋白樣品，按照比例與水化上樣緩沖液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(m/v) CHAPS、2%(v/v)IPG、40 mmol/L DTT)混勻，將高壓滅菌后干燥的濾紙小片置膠條槽兩極，搭建除鹽橋，從負極至正極方向線性加入樣品，膠條膠面朝下，覆蓋于樣品液上，膠條表面加入1.5 mL礦物油防止樣品水化過程中蒸發(fā)。等電聚焦電泳儀設置程序：溫度：17 ℃；最大電流：50 μA；膠條數(shù)：3 gel；等電聚焦程序見表1。

表1 等電聚焦電泳程序Tab.1 The electrophoresis parameter ofisoelectric focusing

1.5 膠條的平衡

等電聚焦程序結束后，將膠條放入含有SDS平衡緩沖液Ⅰ(6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl pH8.8、29.3%(v/v)甘油、2%(w/v)SDS、1%溴酚藍儲備液、1%DTT)的平衡管內，將其平放固定于脫色搖床上平衡14～15 min，一次平衡結束后，取出膠條于超純水沖洗膠條表面后放入含有平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl pH8.8、29.3%(v/v)甘油、2%(w/v)SDS、1%溴酚藍儲備液、2.5%碘乙酰胺)的平衡管中，進行第二次平衡14～15 min。

1.6 SDS-PAGE垂直凝膠電泳(二向)

將平衡好的IPG膠條在1×電泳緩沖液中浸泡3 s，然后用鑷子把膠條轉移至凝膠上，用薄塑料板輕壓膠條使其充分接觸聚丙烯酰胺凝膠，加入含有溴酚藍的低熔點瓊脂糖密封液，保證膠條與凝膠之間沒有氣泡與縫隙，采用12.5%的均勻SDS-PAGE電泳分離膠進行二向電泳，電泳參數(shù)為起始功率2 W/gel，45 min后升至17 W/gel，直至溴酚藍到達凝膠底部結束，運行溫度設置為15 ℃。

1.7 染色

電泳結束后，從玻璃板中取出凝膠并對其進行正負極標記后，染色。

1.7.1 考馬斯亮藍G-250染色(每塊凝膠需250 mL)

①固定液(10%乙酸、40%乙醇)中固定至少30 min；②放入染色液(8%硫酸銨，0.8%磷酸，20%甲醇，0.08%考馬斯藍G-250)過夜；③用水不斷沖洗凝膠進行脫色。

1.7.2 硝酸銀銀染(每塊凝膠需250 mL)

①固定(40%甲醇，10%乙酸)中固定30 min以上或者過夜；②水洗5 min；③30%乙醇洗2×20 min；④水洗6×5 min；⑤0.02%硫代硫酸鈉洗1 min；⑥水洗3×20 s；⑦染色液(0.2% AgNO3，0.02%甲醛)潤洗去除殘留的硫代硫酸鈉，再加入足量染色液反應20 min；⑧水洗3×20 s；⑨顯影液(3%Na2CO3，0.05%甲醛，0.000 5%Na2S2O3)潤洗去除殘留的染色液后顯色；⑩終止(5%醋酸)5 min；水洗20 s將膠保存在蒸餾水中。

1.8 圖象掃描與軟件分析

用Bio-6000透射掃描儀(上海中晶科技有限公司)對凝膠進行圖像掃描，掃描參數(shù)：分辨率：300 dpi，掃描模式為灰階、透射掃描。保存為TIF格式。用Image Master 2D Plattinum 7.0軟件(美國GE公司)對掃描圖像(每個樣品3次重復)進行分析。

2 結果

2.1 不同裂解液配方和蛋白純化方法的2-DE圖譜

不同的裂解液配方對蛋白質的溶解和提取效果存在顯著差異，為避免不必要的蛋白質損失，減少人為修飾對蛋白質的影響，降低樣品的離子強度，蛋白質樣本的制備程序須通過反復實驗才能摸索到最優(yōu)條件[18]。本實驗采用2種不同的裂解液配方對蛋白的提取效果進行了比較(如圖1)，蛋白純化方式均為丙酮沉淀法。實驗結果顯示：采用DTT取代Tris和TBP的裂解液Ⅱ的蛋白得率和條帶清晰度高于裂解液Ⅰ，可促進蛋白的溶解。

有效的蛋白純化方法可以顯著提高雙向電泳圖譜的質量，本實驗使用上述優(yōu)化所得的裂解液配方Ⅱ，對丙酮沉淀法和2D clean-up試劑盒法二種純化方式對雙向電泳圖譜的影響進行比較。從圖2-a中可以看出，丙酮法純化蛋白質所得的雙向電泳圖譜在偏中性區(qū)域內存在一定的蛋白質丟失且橫條紋稍多，蛋白點較少。利用Image Master 2D Platinum軟件分析圖像可獲得286個蛋白點。2D clean-up試劑盒法純化蛋白質所得的雙向電泳圖譜上(圖2-b)蛋白點覆蓋范圍廣且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白點數(shù)量均有所增加，利用軟件分析獲得了418個蛋白點，相比于丙酮法增加了132個蛋白點，蛋白點分離明顯且恢復量較大。

(a)裂解液Ⅰ；(b)裂解液Ⅱ

(a)丙酮沉淀法；(b)2D clean-up試劑盒法

2.2 IPG膠條分離范圍的選擇

一向等電聚焦是根據(jù)被分離蛋白質組分間的等電點差異來進行，不同等電點的蛋白質以預制IPG膠條為載體遷移到其等電點(pI)的pH處。本研究采用最常用的pH 3～10和pH 4～7的IPG膠條(24 cm)對分離效果進行了比較。結果顯示(圖3)使用pH 3～10的膠條圖譜(圖3-a)分離效果不佳，在堿性區(qū)域蛋白點分布較少且水平拖尾現(xiàn)象嚴重，清晰可見的蛋白點不多；采用pH 4～7的IPG膠條圖譜(圖3-b)中蛋白點分布于整塊凝膠且清晰，橫條紋較少，蛋白質被有效分離。

2.3 不同上樣量的優(yōu)化

在一向等電聚焦中的蛋白樣品上樣量是影響雙向電泳圖譜結果的重要因素。本實驗比較了100、150、200 μg三種不同上樣量以獲得進行雙向電泳的最佳上樣量，得到的雙向電泳圖譜如圖4(a)(b)(c)所示。結果顯示，當上樣量為100 μg時，圖譜(圖4-a)上可以獲得清晰的蛋白點，拖尾現(xiàn)象不明顯，但蛋白點總體偏少。而上樣量為150 μg時，圖譜(圖4-b)上獲得的蛋白點多且清晰，邊界分明，橫條紋較少；上樣量為200 μg時，圖譜(圖4-c)上獲得的蛋白點多，但部分區(qū)域的蛋白點橫條紋較多，在酸性端和堿性端模糊不清，蛋白點分離效果不佳。

(a)pH3-10；(b)pH4-7

圖3 不同pH的IPG膠條所得的2-DE圖譜
Fig.3 The 2-DE map of different pH IPG strips

(a)100 μg;(b)150 μg;(c)200 μg

2.4 不同染色方法的影響

不同的雙向電泳凝膠染色方法對電泳圖譜分辨率有著很大的影響，圖譜分辨率的高低往往會干預后續(xù)蛋白點的分析與鑒定。本實驗采用硝酸銀染色法(以下簡稱“銀染”)和考馬斯亮藍G-250染色法(以下簡稱“考染”)比較分析其對雙向電泳圖譜結果的影響。結果如圖5所示，考染圖譜(圖5-a)橫條紋較多，堿性端蛋白點較少，部分區(qū)域蛋白點沒有被清晰分離或顯色。多數(shù)低豐度蛋白點沒有被清晰分離或顯色；銀染圖譜(圖5-b)蛋白點較多且比較清晰，蛋白點與凝膠背景的對比性較高，能較完整地表明全蛋白信息。

(a)考染；(b)銀染

3 討論

建立一套有效的、可重復的樣品制備方法是雙向電泳成功的關鍵因素，也是獲得高質量電泳參考圖譜的必要因素[18-19]。本實驗通過向裂解液配方中添加DTT來取代Tris和TBP，獲得了蛋白得率和條帶清晰度高的圖譜。DTT作為還原劑可以裂解蛋白質結構中的二硫鍵，使待分析的樣本蛋白處于完全還原狀態(tài)，使變性的蛋白質完全伸展促進溶解。在其他的裂解液固定成分中，尿素、硫脲、CHAPS、IPG buffer和三種蛋白酶抑制劑也起到很重要的作用，尿素和硫脲聯(lián)用打開了蛋白的三維結構，顯著增強裂解液的溶解能力；雙性離子去垢劑CHAPS可溶解膜蛋白，從而解除蛋白之間的相互作用，降低樣品的離子強度[14]。微量的IPG buffer加入有助于減少蛋白聚合的機率，增強蛋白質基質間的疏水作用，從而有助于蛋白充分溶解；蛋白酶、磷酸酶、PMSF為蛋白酶抑制劑，可抑制多種蛋白酶活性，防止蛋白質降解，保持蛋白的完整性。

蛋白質經(jīng)裂解液裂解后，若樣品未經(jīng)純化，其中的非蛋白質類雜質會影響等電聚焦過程，使電壓無法升到最高值導致聚焦不完全，為防止蛋白樣品丟失，減少雜質(如鹽、去污劑、核酸、脂類等)殘留污染對等電聚焦過程的影響[20]，進而獲得蛋白點清晰、分辨率高的雙向電泳參考圖譜，本實驗對比分析了丙酮沉淀法和2D clean-up試劑盒法兩種蛋白純化方式。結果發(fā)現(xiàn)丙酮沉淀法純化后的蛋白點數(shù)明顯減少，這與丙酮沉淀導致大量的蛋白質丟失有關，且丙酮與試管具有一定的親和性，可能也會影響到本實驗結果；而使用2D clean-up試劑盒純化后的蛋白點數(shù)明顯增加且分辨率高，這得益于其本身利用獨特的沉淀劑和輔助沉淀劑，能有效定量沉淀樣本蛋白質，并將干擾物質留在溶液中減少污染殘留，與其他純化方法比較，蛋白沉淀容易復溶，蛋白恢復量大，操作簡單。據(jù)國外文獻報道，Popovabutler等[21]對白紋伊蚊的刷狀緣膜囊泡蛋白的研究和Laz等[22]對小鼠肝臟蛋白的研究中，均采用2D clean-up試劑盒純化蛋白樣品，并獲得了高質量的雙向電泳圖譜。

不同生物所含蛋白質的等電點也各不相同，選擇合適分離范圍的IPG膠條是有效分離蛋白質的必要因素[23]。若IPG膠條的分離范圍選擇不合適，則會導致蛋白大量集中在某一區(qū)域而不易被分離，從而影響圖譜質量。研究表明，生物中大多數(shù)蛋白的等電點介于pH4-8之間，使用pH3-10分離范圍的膠條適于顯示樣品中大部分的蛋白質，但在電泳圖譜中間偏酸性端區(qū)域內會有大量的蛋白點聚集，兩端的蛋白點偏少，使得中間蛋白點的分辨率較低[22]，這樣往往導致遺失具有重要生物功能的低豐度蛋白質，相較于窄pH范圍的膠條雖然蛋白覆蓋率沒有寬膠條的廣，但可以得到相對分辨率高的蛋白質點[24]。申欣等[9]對西施舌鰓蛋白和薛寶貴等[14]對大菱鲆表皮蛋白的研究中，均采用pH4-7的IPG膠條，所得的雙向電泳圖譜蛋白點清晰并且覆蓋范圍廣，最終分析得到的生物信息也比較完整。結合本研究的結果，應進一步使用窄pH值范圍膠條，以期能獲得草魚鰓蛋白最優(yōu)的雙向電泳圖譜。

蛋白樣品上樣量能較大程度上影響雙向電泳圖譜蛋白點數(shù)和質量，是獲得樣本完整生物學信息的關鍵因素[25]。在蛋白上樣量較低情況下往往會檢測不到部分低豐度蛋白從而使蛋白點總體偏少，無法體現(xiàn)雙向電泳圖譜上的蛋白點完整性。在蛋白上樣量較高情況下雖有利于檢測到低豐度蛋白質；但上樣量過多又會導致部分區(qū)域高豐度蛋白聚集或沉降，使得有些蛋白質點分離效果不明顯，并且隨著上樣量的增加造成鹽離子濃度偏大，從而影響等電聚焦的過程，造成橫條紋和拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)[26]。因此需要找出最合適的蛋白樣品上樣量。本實驗中蛋白樣品上樣量為150 μg時雙向電泳圖譜效果最佳，雖然蛋白點數(shù)與200 μg上樣量相比時較少，但蛋白點更加清晰且避免了高豐度蛋白的影響，更適合于雙向電泳圖譜的分析。劉志遠等[12]在中國明對蝦(Litopenaeusvannamei)肌肉組織蛋白質雙向電泳技術體系的建立實驗中采用17 cm，pH4-7的IPG膠條對三個不同的上樣量100 μg、120 μg、150 μg條件下的電泳情況進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)較高上樣量會使部分蛋白堆積，過低上樣量使得部分低分度蛋白消失，因此選擇上樣量為120 μg的電泳圖譜較好。與本實驗相比過程相似，但具體的上樣量不同可能與實驗對象和采用的膠條大小不同有關，本實驗中所采用的是24 cm的IPG膠條。

銀染和考染是2種常用的凝膠染色方法，不同的染色方法靈敏度具有一定的差異，將很大程度上影響蛋白點的分析和檢測[27]。就本實驗兩種方法對比而言：考馬斯亮藍G-250染色法存在靈敏度低、染色時間長、上樣量較多等缺點，并且上樣量增加將導致高豐度蛋白聚集而引起大量橫條紋；銀染法具有操作時間短、靈敏度高、背景清晰、橫條紋較少等優(yōu)點，總體上銀染效果優(yōu)于考染。秦慧等[28]對幾種雙向電泳凝膠染色方法進行了比較，指出銀染的靈敏度高于考染，但同時也發(fā)現(xiàn)考染方法在蛋白點質譜鑒定方面兼容性比銀染高，因此后續(xù)進行蛋白質點的分析時應選用銀染法，而在進行質譜鑒定時應選用考染法。

本實驗建立的草魚鰓組織蛋白質雙向電泳技術體系，相較于申欣等[9]建立的西施舌鰓蛋白質組的雙向電泳體系，同樣對鰓組織蛋白質的提取過程中裂解液成分、IPG膠條的分離范圍、染色方法進行了優(yōu)化。但本實驗增加了蛋白裂解后的純化過程來減少雜質，以此保證蛋白質的充分制備和良好的等電聚焦過程，優(yōu)化后選擇了易復溶，恢復量大，操作簡單的2D clean-up試劑盒法，并對上樣量進行了優(yōu)化，合適的上樣量可以獲得更優(yōu)的圖譜效果。

綜上所述，本實驗建立的草魚鰓組織蛋白質雙向電泳技術體系：通過有較強裂解能力的蛋白樣品制備液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v) CHAPS，2%(v/v)IPG buffer、40 mmol/L DTT和0.5%(v/v) 蛋白酶、磷酸酶、PMSF抑制劑]，結合2D clean-up試劑盒法提取草魚鰓蛋白，使用24 cm pH 4～7的固相IPG膠條進行一向等電聚焦，主動水化上樣150 μg，電泳結束后采用銀染并掃描獲取凝膠圖譜。通過以上各步驟的優(yōu)化，基本建立了草魚鰓組織蛋白質雙向電泳技術體系，該體系能夠有效將草魚鰓蛋白質充分分離，獲得覆蓋范圍廣和分辨率高的雙向電泳圖譜，為后續(xù)草魚在抗病毒和低氧脅迫下鰓組織蛋白質差異化分析研究提供技術基礎。

[1] 蔣 昊.中國明對蝦在脅迫條件下肝胰臟的差異蛋白質組學研究[D].青島：中國科學院海洋研究所，2009.

[2] Anderson N G,Anderson N L.Twenty years of two-dimensional electrophoresis:past,present and future.[J].Electrophoresis,1996,17(3):443.

[3] 夏其昌,曾 嶸.蛋白質化學與蛋白質組學[M].北京：科學出版社，2004.

[4] Carrera M，Carras B，Gallardo J M.Proteomics for the assessment of quality and safety of fishery products[J].Food Res Int，2013，54(1):972-979.

[5] Slattery M，Ankisetty S，Corrales J，et al.Marine proteomics:a critical assessment of an emerging technology[J].J Nat Product，2012，75(10):1833-1837.

[6] Forné I，Abián J，Cerdà J.Fish proteome analysis:Model organisms and non-sequenced species[J].Proteomics，2010，10(4):858-872.

[7] Martinez I，Slizyte R，Dauksas E.High resolution two-dimensional electrophoresis as a tool to differentiate wild from farmed cod (Gadusmorhua) and to assess the protein composition of klipfish[J].Food Chem，2007，102(2):504-510.

[8] 趙永強，李 娜，李來好,等.水產品質量與安全控制的蛋白質組學研究[J].大連海洋大學學報，2016，31(3):344-350.

[9] 申 欣，田 美，孟學平,等.西施舌鰓蛋白質組學研究[J].安徽農業(yè)科學，2010，38(19):10096-10098.

[10] 張瓊宇，謝錦云，趙如榕,等.不同發(fā)育階段草魚腎臟蛋白質組差異的初步分析[J].水生生物學報,2006，30(4):425-431.

[11] Mezhoud K，Bauchet AL，Chteau-Joubert S，et al.Proteomic and phosphoproteomic analysis of cellular responses in medaka fish (Oryziaslatipes) following oral gavage with microcystin-LR[J].Toxic Off J Int Soc Toxinol，2008，51(8):1431-1439.

[12] 劉志遠，勵建榮，李學鵬,等.中國明對蝦肌肉組織蛋白質雙向電泳技術體系的建立[J].水產學報,2013，37(2):288-296.

[13] 趙永強，李 娜，李來好,等.尼羅羅非魚肌肉蛋白質雙向電泳體系的建立[J].水產學報，2016，40(10):1648-1656.

[14] 薛寶貴，黃智慧，周 洲,等.大菱鲆表皮蛋白質組雙向電泳技術的建立及優(yōu)化[J].漁業(yè)科學進展，2011，32(2):41-46.

[15] 鄭國棟，陳 杰，蔣霞云,等.長江草魚不同群體EST-SSR多態(tài)性標記的篩選及其遺傳結構分析[J].水生生物學報，2015，39(5):1003-1011.

[16] 吳海慶，李明云，葉帥東,等.大彈涂魚肝臟蛋白質雙向電泳技術的建立及優(yōu)化[J].生命科學儀器，2009,7(8):33-36.

[17] 李青梅,陳利軍,饒友亮,等.草魚鰓介導草魚呼腸孤病毒免疫應答(英文)[J].水生生物學報，2014,(5):834-840.

[18] Lilley K S，Razzaq A，Dupree P.Two-dimensional gel electrophoresis:recent advances in sample preparation，detection and quantitation.[J].Curr Opin in Chem Biol，2002，6(1):46-50.

[19] Blackstock W P，Weir M P.Proteomics:quantitative and physical mapping of cellular proteins.[J].Trend Biotech，1999，17(3):121.

[20] 王 瑞，傅玲琳，王彥波.副溶血弧菌總蛋白雙向電泳體系的建立[J].中國食品學報，2013，13(12):146-155.

[21] Popovabutler A，Dean D H.Proteomic analysis of the mosquito Aedes aegypti midgut brush border membrane vesicles[J].J Insect Physiol，2009，55(3):264-272.

[22] Laz E V，Wiwi C A，Waxman D J.Sexual dimorphism of rat liver nuclear proteins:regulatory role of growth hormone.[J].Mole Cell Proteom Mcp，2004，3(12):1170.

[23] Ong S E，Pandey A.An evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in proteomics[J].Biomol Engin，2002，18(5):195-205.

[24] 張 麗，姜 麗，石 韻,等.桃果實總蛋白質雙向電泳優(yōu)化體系的建立[J].食品與生物技術學報，2013,32(3):250-257.

[25] 李明云，冀德偉，吳海慶,等.大黃魚肝臟蛋白質組雙向電泳技術的建立及優(yōu)化[J].水產科學，2010,29(1):27-30.

[26] G?rg A，Boguth G，Obermaier C，et al.Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG-Dalt):the state of the art and the controversy of vertical versus horizontal systems[J].Electrophoresis，1995，16(7):1079-1086.

[27] Pink M，Verma N，Rettenmeier A W，et al.CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility.[J].Electrophoresis，2010，31(4):593-598.

[28] 秦 慧，劉 霆，柳 斌,等.幾種雙向凝膠電泳蛋白質檢測方法的比較[J].中國實驗血液學雜志，2006,14(1):168-172.

Establishmentandoptimizationof2-DEtechniqueingillproteinofCtenopharyngodonidella

XU Zhan-ning，LI Fu-gui，CHEN Jie，JIANG Xia-yun，ZOU Shu-ming

(KeyLaboratoryofGeneticResourcesforFreshwaterAquacultureandFisheries，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

2017-05-18；

2017-08-03

“十二五”國家863計劃主題項目(2011AA100403)；上海高校知識服務平臺(ZF1206)

徐湛寧(1993- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向為水產動物遺傳育種。E-mail：653054759@qq.com

鄒曙明。E-mail:smzou@shou.edu.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)05-0014-07